从水通道蛋白4的表达探讨脾胃湿热证的机理

作者：xls_health
发表于: 08/11 11:32
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(齐康网)

中医认为脾主运化、主升清、主统血，为后天之本。脾在五脏中的重要地位是学术界对其研究一直没有停止的原因。近年来脾实质的研究，证型上集中在脾虚证的研究，功能上集中在“脾主运化、尤其脾主运化水谷”的研究，而关于脾胃实证和“脾主运化水液”的研究较少［１－２］。现代医学认为，水通道蛋白(aquaporin，AQP)是生物膜上特异性转运水的整合蛋白质，参与调节水平衡；在胃粘膜中主要是AQP4的表达［３５］。本文以水液代谢为切入点，研究脾胃湿热证与AQP4之间的关系。

　　1 资料

　　11 一般临床资料

　　从2002年1月到2002年10月在广州中医药大学第一附属医院门诊部和住院部共收集慢性浅表性胃炎患者57例，其中辨证属脾胃湿热证者35例，脾气虚证者22例。另选取正常人10例作为对照，来自广州中医药大学第二临床医学院的本科志愿学生。所有受试对象均签订知情同意书。脾胃湿热证组中，男19例，女16例，年龄18～４０岁，平均(253±57)岁；脾气虚证组中，男12例，女10例，年龄１８～４２岁，平均(294±77)岁；正常组10例，年龄１８～２５岁，平均(214±17)岁。

　　12 诊断标准

　　121 西医诊断标准慢性浅表性胃炎的诊断标准参照中华医学会消化病学分会2000年井冈山会议制定的标准［６］。

　　122 中医诊断标准脾胃湿热证和脾气虚证的诊断标准参照2002年国家药品监督管理局颁布的《中药新药临床研究指导原则》［７］。

　　脾胃湿热证：主症为①脘腹胀闷；②口渴少饮；③食少纳呆；④大便溏而不爽；⑤舌质红，舌苔黄腻。次症为：

　　①肢体困重；②身热不扬或汗出不解；③腹胀满；④恶心欲吐；⑤身目黄色鲜明；⑥脉濡数。具备主症3项(舌象必备)；或具备主症两项(舌象必备)，加次症两项，即可诊断为脾胃湿热证。

　　脾气虚证：主症为①食少纳呆；②体倦乏力；③食后或午后腹胀；④大便异常(溏、烂、先硬后溏、时溏时硬)。次症为①神疲懒言；②口淡不渴；③腹痛绵绵；④恶心呕吐；⑤脘闷或肠鸣；⑥面色萎黄；⑦浮肿；⑧排便无力；⑨舌质淡，舌体胖或有齿印，苔薄白；⑩脉细弱。具备主症两项；或具备主症1项加次症两项，即可诊断为脾气虚证。

　　123 正常人的诊断标准无心、肝、脾、肺、肾等系疾病，常规实验室检查正常，胃粘膜胃镜征象和病理组织学基本正常，舌、脉象正常。

　　

　　13 试验材料与仪器羊抗人AQP4的多克隆抗体购自Sants Cruz生物技术有限公司；生物化二抗、链霉素亲和素生物素复合物法(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德公司；Trizol、Taq DNA多聚酶、MMV逆转录酶、四种脱氧核糖核酸(dNTPs)购自美国Gibco公司；参照NCBI的genbank，AQP4引物和荧光探针由中山大学达安基因诊断中心设计合成，序列为：正义链引物5GAATCCCGCCCGATCCT3’，反义链引物5ATATCCAATGGTTTTCCCAATTTC3’，荧光探针5FAMTGGACCTGCAGTTATCATMGB3(探针的5端标以荧光报告基因FAM，3’端标以荧光淬灭基因MGB)，AQP4扩增片段长度为62?bp；GeneAmp PCR System?9700(普通PCR仪)和ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(全自动荧光定量PCR仪)，均为美国Applied Biosystems公司产品；GIF-240XQ型电子胃镜为日本Olympus公司产品。

　　2 方法

　　21 病理取材所有受试对象均行电子胃镜检查，胃体距EG线?2?cm处的大、小弯处分别钳取胃粘膜组织4块，每块?05?cm×?05?cm大小，2块组织放入?40g/L?多聚甲醛中，2块组织放入液氮罐中。

　　22 AQP4表达的检测根据获得的组织数目，慢性浅表性胃炎患者分别用两种方法检测，脾胃湿热证组中20例行免疫组化检测，15例行荧光定量基因检测；脾气虚证组中12例行免疫组化检测，10例行基因检测；正常人10例均用两种方法检测。

　　221 免疫组织化学法组织包埋切片后，Ｈ２Ｏ２封闭，微波法热修复抗原，血清封闭液封闭，分别滴加羊抗人AQP4的多克隆抗体、生物化二抗和SABC，DAB显色，苏木素衬染，透明封片。显微镜下观察，细胞膜上有黄色或棕褐色颗粒为阳染细胞，参考邢氏等的标准［８］，以阳染强度×阳染面积比例作为阳性表达指数(蛋白表达量)。阳染强度标准：无阳染细胞计0分，细胞阳染呈浅黄色计1分，阳染呈棕黄色计2分，阳染呈棕褐色计3分。阳染面积比例计算方法：高倍镜下5个视野，计数至少500个细胞中的阳性细胞数，以百分数表示阳染面积比例。

　　222 荧光定量PCR法

　　2221 总RNA的提取胃粘膜组织加入Trizol，进行匀浆、分层、浓缩、沉淀、洗涤和溶解。每份样品在紫外分光光度计上测定?260?nm?和?280?nm吸光度值，计算总RNA的提取率和纯度。

　　2222 逆转录反应取1μg总RNA，加入MMV逆转录酶?10?U、25?μmol/L下游引物?05μL、dNTPs1μL、buffer缓冲液2μL、焦碳酸二乙酯(DEPC)水35μL，PCR仪中37℃反应1h，然后95℃3?min。

　　

　　2223 阳性标准模板的制备取逆转录反应产物cDNA?5?μL，加入上下游引物、Taq DNA多聚酶、dNTPs等，PCR仪中93℃反应?2?min，然后９３℃变性?1?min，55℃退火?1?min，72℃延伸?1?min，共40个循环，最后是７２℃延伸?7?min。琼脂糖凝胶电泳，割下目的条带，回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回收纯化。紫外分光光度计上测定，根据D?260?nm?测定值和片段长度数据换算出浓度(拷贝数/μL)，做梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度。荧光定量阴性对照品采用双蒸水。

　　2224 FQ-PCR测定不同浓度阳性定量标准品及待测样本的cDNA ?5?μL，加入上下游引物、荧光探针、Taq DNA多聚酶、dNTPs等，荧光定量PCR仪中９３℃?2?min，然后９３℃?1?min，55℃?1?min，７２℃延伸?1?min，共35～４０个循环。反应结束后，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果。

　　23 统计方法采用方差分析。

　　3 结果

　　31 AQP4蛋白表达的比较显微镜下观察，AQP4主要表达在粘膜固有层中，分布在胃腺主细胞膜和壁细胞膜的基侧面。脾胃湿热证组阳性染色(阳染)呈深棕黄色，阳染面积比例大(图1-a)；脾气虚证组阳染呈浅棕色，阳染面积小，或无阳染(图1-b、c)；正常组阳染强度中等，阳染面积也较大(图1-d)。组间阳染结果量化比较：脾胃湿热证组AQP4蛋白表达量(ＩAQP4positive)高于脾气虚证组(Ｐ＜００1)和正常组(Ｐ＜００５)；脾气虚证组蛋白表达量低于正常组，但两组比较无显著性差异(Ｐ＞００５)(见表1)。

6018

　　表1 3组患者AQP4蛋白表达的比较（略）

　　Table 1 Comparison of AQP4 protein expression in the three groups

　　与正常组比较(vs group C)，Ｐ＜００５，Ｐ＜００1；＃与脾气虚证组比较(vs group B)，Ｐ＜００５，＃＃Ｐ＜００1(下同)

　　32 AQP4基因表达的比较

　　脾胃湿热证的荧光生长曲线呈明显阳性；脾气虚证的荧光反应较弱，有1例呈现阴性，有3例呈现可疑阳性；正常组荧光生长曲线居于两组之间。参照标准曲线定量后，取拷贝数的对数进行方差分析。结果发现：脾胃湿热证组AQP4 mRNA表达量高于脾气虚证组(Ｐ＜００1)，其mRNA表达量虽高于正常组，但两组之间无显著性差异(Ｐ＞００５)；而脾气虚证组AQP4基因表达量则低于脾胃湿热证组(Ｐ＜００1)和正常组(Ｐ＜００５)(见表2)。

　　4 讨论

　　水平衡是维持生命的关键因素之一。既往认为，水以简单扩散的方式通过生物膜。近年研究发现，在多种器官组织的细胞膜上存在着一种整合蛋白质，即水通道蛋白，它能特异性地介导水转运，是水通过生物膜的主要方式［３－４］。1988年首次从哺乳动物红细胞膜上分离出AQP1［９］，目前已成功分离10个亚型［４，１０－１１］。AQP功能与其选择性分布有关，对维持细胞、组织、器官及全身的水平衡起着决定性作用；如果不同细胞膜上的AQP表达超过或低于正常水平，都会影响水的分泌或吸收，出现局部或全身水平衡紊乱［３－４］。

　　目前在消化道已发现有7种AQP亚型［１２］。正常情况下，人体每天通过唾液腺、胃、肝胆、胰腺、小肠、结肠等器官的上皮吸收或者分泌的液体量超过9L，而这些液体在细胞内外的进出可能都与AQP有关。人体的胃组织主要是AQP4表达，且只表达在胃底腺主细胞和壁细胞的膜上，功能是参与胃液的分泌，和/或参与维持壁细胞正常容积［５］。AQP4的作用强度可能与以下因素有关：蛋白表达量、细胞膜上的排列方式、单位膜面积的分布强度等［１３］。有实验表明［１３-１４］，AQP4剔除基因鼠的壁细胞对水的渗透性下降，胃酸分泌量和对组胺的刺激均较野生型低。

　　脾主运化一方面将水谷化为精微以营养全身，另一方面把水谷精微中的水分化为精、血等生理性液体输布全身；并将多余的水液化生为唾、汗、尿，转输至肺、肾排出体外。“脾主运化”的功能健旺，可防止体内水液不正常的停滞，维持体内津液平衡；如脾(胃)运化功能失常，则易湿浊内生，聚而化热，形成脾胃湿热证。可见，脾胃湿热证是“脾主运化”的功能失调，水液代谢障碍的结果。

　　本实验发现，AQP4主要分布在胃腺主细胞膜和壁细胞膜的基侧面，在粘膜固有层中表达，而在细胞膜的顶部及粘液上皮细胞未见表达，这些与Misaka等［５］的观察结果一致。

　　表2 3组患者AQP4 mRNA表达量的比较（略）

　　

　　Table 2 Comparison of AQP4 mRNA　expression in three groups

　　a.脾胃湿热证组AQP4高表达(high expression of AQP4 in group A,×400)

　　b.脾气虚证组AQP4低表达(low expression of AQP4 in group B,×400)

　　c.脾气虚证组AQP4阴性表达(negative expression of AQP4 in group B,×400)

　　d.正常组AQP4的表达(AQP4 expression in group C,×400)

　　图1 各组AQP4蛋白表达的比较（略）

　　

　　Figure 1 Comparison of AQP4 expression in different groups

　　研究结果显示：脾胃湿热证AQP4蛋白表达及基因表达均升高，而脾气虚证AQP4蛋白及基因表达均低下，组间比较差异具有显著性(Ｐ＜００1)，提示脾胃湿热证和脾气虚证在水液代谢方面有不同的改变，至于两证型与AQP4表达间的确切相关性，有待进一步研究；脾胃湿热证基因表达虽高于正常组，脾气虚证蛋白表达低于正常组，但均无统计学差异，可能与样本数偏小有关，有待扩大样本量以深入研究。

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