乙型肝炎表面抗原124aa分子在大肠杆菌中的高效表达

作者：123456mama
发表于: 07/04 06:42
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(齐康网)     作者：房德兴李法卿谭维国陈华标金慧英李素芹

    单位：南京军区军事医学研究所南京 210002

    关键词：乙型肝炎病毒乙型肝炎表面抗原大肠杆菌基因表达

    免疫学杂志990310 摘要利用聚合酶链反应特异性扩增编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)羧基末端124个氨基酸的基因片段，并将其在大肠杆菌中获得了高效表达。表达产物氨基末端有1个含6组氨酸肽段的20氨基酸融合部分，分子量16178Da，以包含体形式存在，约占细菌总蛋白的22%。以HiTrap亲和层析纯化，纯度可达95%以上。分别用抗HBsAg多克隆抗体和抗HBsAg a单克隆抗体进行ELISA检测表明，该蛋白具有HBsAg反应原性。

    中图号 R392.1

    EXPRESSION OF THE HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN FRAGMENT WITH 124 AMINO ACIDS IN E.coli

    Fang Dexing，Li Faqing，Tan Weiguo，Chen Huabiao，Jin Huiying，Li Suqin

    (Huadong Research Institute of Medical Biotechnics，Nanjing 210002)

    Abstract The gene fragment coding the 124 amino acids of the carboxyl terminus of hepatitis B surface antigen(HBsAg)was amplified by polymerase chain reaction(PCR)and the shorted HBsAg was expressed in E.coli in a fusion protein fashion.The fusion protein was 16178Da in molecular weight and contained a 20-amino-acid fusion portion at its amino terminus which contained a six-histidine peptide segment.The expressed proteins aggregated into inclusion bodies weigh about 22% of the total bacteria proteins.It was easily purified with the HiTrap affinity matrix with a purity up to 95%.ELISA detection showed that the protein could be recognized by polyclonal antibodies against HBsAg and monoclonal antibody against HBsAg a determinant.

    Key words Hepatitis B virus，Hepatitis B surface antigen，E.coli，Gene expression

    在当前和今后相当长的一段时间内，疫苗注射仍是预防、控制乙型肝炎的最主要手段之一。随着血源疫苗的逐渐被淘汰，基因工程将是获得乙型肝炎疫苗的唯一途径。由于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)本身的结构特点，在早期的研究中，人们发现原核系统(大肠杆菌)表达的蛋白没有活性(抗原性)，因此将注意力转到真核表达系统中^[1]。在HBsAg真核表达方面，国内外已做了大量工作，除了酵母菌外，还使用过各种各样的哺乳细胞，如3T3细胞、非洲绿猴肾细胞、中国地鼠卵巢细胞等。虽然目前已经开始推广使用基因工程乙型肝炎疫苗，但众所周知，真核系统途径的表达量远远难以满足巨大的市场需求；同时所采用的传代细胞系也存在诸多弊端。有高效表达水平的原核系统用于乙型肝炎疫苗生产的潜力和吸引力始终存在。

    在分析已知乙型肝炎病毒(HBV)基因组结构的基础上，本研究扩增了编码主要中和性a抗原决定簇的HBsAg羧基末端124个氨基酸的基因片段，并在大肠杆菌中获得了高效表达。利用抗HBsAg a抗原决定簇单克隆抗体(McAb)和抗HBsAg多克隆抗体(PcAb)初步检测表明：这种截短的HBsAg分子具有抗原活性。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    菌种E.coli TG1，质粒pUC18，中国科学院上海生物化学研究所甘人宝研究员惠赠；菌种E.coli BL21(DE3)，质粒pET-28a(+)由本研究所朱敏生博士惠赠。各种限制性内切酶(Promega公司或华美生物工程公司)；T4DNA连接酶、Tag DNA聚合酶(Promega公司)；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Promega公司)；HiTrap凝胶(Pharmacia公司)；抗a McAb S17(卫生部上海生物制品研究所)；HBsAg ELISA试剂盒(本所产品)；PCGENE计算机软件(Release 6.70，IntelliGenetics公司)。

    1.2 引物设计与DNA扩增利用PCGENE计算机软件，分析已知的HBV基因组序列，结合国内克隆的HBsAg编码区^[2]序列设计、合成寡核苷酸引物，进行常规聚合酶链反应(PCR)扩增。

    ^ 这里列出了48个HBV全基因组序列(其它若干S基因部分序列没有被引用)，它们的基因名称为：HBHEPB，HEHBVAYR，HBU46935，HBVADR，HBVADR4，HBVADW，HBVADW2，HBVADW4A，HBVAYWC，HBVAYWCI，HBVAYWE，HBVAYWGEN，HBVAYWMCG，HBVB5HK01，HBVCGWITY，HBVDNA，HBVP2CSX，HBVP3CSX，HBVP4CSX，HBVP4PCXX，HBVP5PCXX，HBVP6CSX，HBVP6PCXX，HBVXCPS，HPBA11A，HPBA1HKK2，HPBA2HMS2，HPBA2HYS2，HPBADR1CG，HPBADRA，HPBADRC，HPBADRM，HPBADW1，HPBADW2，HPBADW3，HPBADWZ，HPBADWZCG，HPBAYW，HPBB4HST1，HPBC4HST2，HPBC5HK02，HPBC6T588，HPBCG，HPBCGADR，HPBHBVAA，HPBMUT，HPBVCG，ZZHEPAV1.3 基因克隆与表达质粒的构建按常规方法进行，所涉及的质粒DNA抽提、限制性酶切、DNA连接和细菌转化等均参考文献[3]。

    1.4 SDS-PAGE分析按参考文献[3]进行SDS-PAGE分析，采用5%浓缩胶、15%分离胶。经考马斯亮蓝R250染色后以密度扫描仪确定目标蛋白占细菌总蛋白的百分比。

    1.5 表达产物的纯化按HiTrap凝胶层析试剂盒操作程序进行融合蛋白的纯化。

    1.6 表达产物的抗原性检测采用常规ELISA夹心法进行，分别使用抗HBsAg a McAb和抗HBsAg PcAb作为包被抗体。

    2 结果

    2.1 引物设计与PCR扩增分析下载自美国国家生物技术信息中心(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)的48个HBV基因组序列^，发现在preS/S基因区内除了已知的preS1、preS2和S区的起始密码外，同一开放阅读框架(ORF)内、HBsAg主要中和性a抗原决定簇编码区前还有另外2个完全保守的ATG。根据S基因多蛋白共终止密码子原理，由这两个ATG起始的截短的HBsAg蛋白的长度分别为152和124个氨基酸，参见图1。本研究结合已知的HBV S基因序列(GenBank Accession No.AF013631)^[2]合成上游引物(PHBS3：5’-GCCATATGTTGCCCGTTTGTCCT-3’，黑体字母为起始密码子，加下划线部分为Ndel位点)和下游引物(P66：5’-CACTGCAGGTTTAAATGTATACCCAAAG-3’，黑体字母为终止密码的反密码，加下划线部分为PstI位点)。按常规方法进行PCR，DNA模板为含HBV S基因的重组克隆pMPs19，PCR程序为：94°C/30s，50°C/30s，72°C/60s，26个循环。之后取6μl进行琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的目的DNA条带(图从略)。

    2.2 小HBsAg3(SHBsAg3)基因片段的克隆取上述PCR产物，以NdeI-PstI双酶切后，与同样双

    图 1HBV S基因结构及其编码的病毒囊膜蛋白和相关蛋白的分析

    Fig 1Analysis of the HBV S gene and HBV envelope and its related proteins

    The SHBsAg3(124aa)is expressed in this study.

    酶切pUC18 DNA获得的大片段相连接，获得了预期的重组质粒pHBS3，经酶切鉴定证明连接正确(图从略)。

    2.3 SHBsAg3表达质粒的构建以NdeI-SalI双酶切含SHBsAg3编码区的重组质粒pHBS3 DNA，回收390bp的目的DNA，与同样双酶切的pET-28a(+)载体片段相连接，获得重组表达质粒pEHBS3，见图2。经XbaI-XhoI双酶切证明连接正确(图从略)。

    图 2截短的SHBsAg3表达质粒的构建

    Fig 2Construction of the expression plasmid of the shorted SHBsAg3 fusion protein

    2.4 SHBsAg3的表达、SDS-PAGE分析与蛋白纯化按参考文献[4]进行。该表达产物的氨基末端含有6组氨酸肽段，全长144个氨基酸，推测分子量为16178Da，以包含体形式存在。SDS-PAGE分析表明，表达的融合蛋白大小与预期的相一致，约占细菌总蛋白的22%。取表达菌经超声波裂解获得包含体，以PBSU溶液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素)溶解包含体后，进行HiTrap凝胶亲和层析纯化。纯度可达95%以上(见图3)。

    图 3SHBsAg3融合蛋白表达产物的SDS-PAGE分析

    Fig 3SDS-PAGE analysis of the expressed SHBsAg3

    fusion protein

    Lane 1：molecular weight marker；Lane 2：total proteins of E.coli BL21(DE3)；Lane 3：total proteins of the bacteria containing pET-28a(+)plasmid；Lane 4： a human proinsulin analog fusion protein with a molecular weight of 16.5kD，expressed with the same pET-28a(+)expression system^[4]；Lane 5：total proteins of the expression bacteria；Lane 6：purified SHBsAg3 fusion protein，16.2kD

    2.5 SHBsAg3的抗原性初步分析用常规HBsAg ELISA夹心法和以抗HBsAg a McAb作为包被抗体进行的ELISA夹心法检测初步纯化的SHBsAg3样本，证明其具有HBsAg反应原性。

    3 讨论

    HBV有4个主要PolⅡ启动子：分别为Cp、Sp1、Sp2和Xp。它们转录产生的mRNA都是以cccDNA(-)链为模板的同向正链RNA，转录反应利用同一终止信号和多聚腺苷酸信号^[5～8]，其中Sp1转录产生的RNA长2.4kb，其翻译产物为大HBsAg(L-HBsAg)；Sp2转录产生的RNA长2.1kb，分别产生中HBsAg(MHBsAg)和SHBsAg。由于真核基因表达起始位点存在一定的波动，因此有利用后面的ATG起始产生截短的HBsAg的可能性。如果有这样的次要蛋白存在，它们将是可溶性的，与完整的HBsAg分子形成颗粒性结构完全不同，会影响到正常的免疫效果。深入研究这样的分子有助于阐明可能的乙型肝炎免疫失败原因。

    分析整个HBsAg主蛋白的结构，2个主要的亲水区Ⅰ(aa24～aa79)和Ⅱ(aa99～aa168)镶嵌于3个疏水区(分别位于aa7～aa23、aa80～aa98和aa169～aa226)之间^[9]。HBsAg中和性a抗原决定簇位于主蛋白aa124～aa147区段，在亲水区Ⅱ内，由两对二硫键(分别位于Cys124s-s-Cys137，Cysa139-s-s-Cys147)形成双环(loop)构型^[10]。由图1所知的SHBsAg2和SHBsAg3分别起始于SHBsAg的aa75位和aa103位，包含了整个a抗原决定簇区。

    本文用PCR方法直接扩增SHBsAg3编码区，将其在大肠杆菌中获得了高效表达，并初步证明了其与抗HBsAg PcAb和抗HBsAg a抗原决定簇McAb的反应性，这与先前关于原核系统表达的HBsAg无抗原性的报道不一致，其原因尚不完全清楚，但可能与所用的基因片段有关。在PCR方法诞生之前，克隆和表达HBsAg的工作完全依赖于S基因上已有的酶切位点，所获得的基因片段往往比实际需要的大出很多，那些多余的DNA序列加上融合表达系统本身带有的序列极可能是影响HBsAg表达产物活性的重要原因，而相对较短的基因片段将可能避免这种影响。根据已知的资料^[9]，两个HBsAg主蛋白分子通过二硫键形成的二聚物是具有完全HBsAg抗原性的“基本结构单位”。进一步详细分析截短的SHBsAg3的特性，并与完整的SHBsAg分子比较，探索其作为疫苗成分应用的可能性具有重要的现实意义。相关的研究正在进行中。

    第一作者：男，36岁，博士，副研究员

    参考文献

    1 逯好英，马贤凯.乙型肝炎病毒表面抗原基因在不同生物细胞系统中的表达.国外医学微生物学分册，1986，9：145

    2 房德兴，甘人宝，张倩，等.乙型肝炎病毒表面抗原aa126 Ile→Ser变异株HBsAg的暂时表达和抗原性鉴定.病毒学报，1998，14：1

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    4 房德兴，王永山，周宗安，等.人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达.中国生物化学与分子生物学杂志，1998，14(4)：30

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    10 Carman WF，Zanetti AR，Karayiannis P，et al.Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus.Lancet，1990，336：325

    (1998-06-10收稿；1998-07-31修回) (文章出处：免疫学杂志 1999年第3期第15卷)