慢性粒细胞白血病p53基因功能检测

   慢性粒细胞白血病p53基因功能检测

   癌症 1999年第4期第18卷 基础研究

   作者：毕丹 周淑芸 曾木圣 曾益新

   单位：毕丹 周淑芸 第一军医大学南方医院血液科(广州，510515)；曾木圣 曾益新 中山医科大学肿瘤防治中心(广州，510060)

   关键词：p53；p21；基因；慢性粒细胞白血病

    【摘要】目的：通过以p21作为标志物的功能检测方法了解慢性粒细胞白血病中p53基因功能状况。方法：采用western blot方法检测未经阿霉素诱导及阿霉素诱导后慢粒患者白血病细胞中p53及p21蛋白表达。结果：对25例慢粒患者白血病细胞进行了检测，显示5例p53基因功能异常，其中1例为慢性期，显示p53基因为野生型，但无功能；1例为加速期；3例急变期，分别为急粒变、急单变和多克隆急变，在急淋变中未见。p53基因功能异常者预后差。结论：p53基因功能异常多出现于慢粒急性髓细胞变，与患者预后相关。除因基因本身改变而致p53功能丧失外，慢粒中可能存在p53抑制因子或结合蛋白，致使p53功能丧失。

    中图分类号：R733.72 文献标识码：A 文章编号：1000－467X(1999)04－0404－03

   Functional detection of the p53 gene in chronic myeloid leukemia

   BI Dan1, ZHOU Shu－yun1, ZENG Mu－sheng2, et al.

    1.Hematology Department, Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510515, P.R. China

    2.Cancer Center,Sun Yat－sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R.China

    【Abstract】Objective：To assess endogenous p53 status in Chronic myeloid leukemia (CML),we established a functional assay by use of p21 as a marker.Methods：Western blot was used to detect p53 and p21 protein expression of the CML cells treated with or without the chemotherapeutic drug adriamycin.Results：Samples from 25 CML patients were assessed.We identified p53 gene functional abnormalities in 5 cases,1case in chronic phase,which showed p53 gene was wild type,but was non－functional;1 case in accelerated phase;3 cases in blast crisis,including 2 myeloid blast crisis and 1 mixed blast crisis. No p53 functional abnormalities was found in lymphoid blast crisis.Patients with p53 functional abnormalities had poor prognosis.Conclusions：The results present further evidence that p53 gene functional abnormalities are involved in the pathogenesis of the myeloid progression of CML and are closely related with the prognosis of the disease.There may be p53 suppressor factors or combination proteins which lead to functional inactivation of the p53 gene and it might be one of the mechanisms underlying disease progression of CML.

    Key words：p53;p21;Gene; Chronic myeloid leukemia

    p53基因是重要的肿瘤抑制基因，wtp53基因具有控制细胞周期限制点，调节基因转录，诱导细胞凋亡等多种功能。在慢性粒细胞白血病(CML)中，p53基因异常大多出现于疾病进展期，与CML急变、疗效及预后密切相关。因此，我们根据p53对p21的调控机理，以p21做为标志物，应用蛋白印迹杂交技术直接检测CML中p53蛋白功能，探讨p53基因功能状况在CML慢性期及急变中的作用及其临床意义。

    1 材料与方法

    1.1 标本来源

    25例CML病人，男性17例，女性8例，其中慢性期14例，加速期4例，急变期7例。所有患者均经FAB分型、单克隆抗体免疫分型、bcr/ablmRNAPCR检测等确诊。急性期患者外周血或骨髓中的白血病细胞数均在50％以上。

    鼻咽癌细胞株Fadu做阳性对照，HL－60细胞株做阴性对照。正常人外周血标本做正常对照。

    1.2 方法

    1.2.1 取材：抽取肝素抗凝的外周血或骨髓，使白细胞含量慢性期在5×107以上，急变期在1×108以上。用等体积RPIM1640稀释，置淋巴细胞分离液上，1800rpm离心20分钟，收集界面的单个核细胞。RPIM1640洗涤两次，含10％小牛血清的1640重悬细胞，将细胞按1～2.5×105/ml密度等量分于两个培养瓶中。

    Fadu，HL－60细胞从液氮冻存中复苏后，置含10％小牛血清的1640培养基中37℃、5％CO2培养4天后收集细胞，将细胞等量分于两个培养瓶中，每瓶细胞数约1×107。

    1.2.2 培养：参照文献[1]进行。将两个培养瓶中的一瓶按0.2μg/ml加入阿霉素，称阿霉素组，另一瓶不加，为对照组，培养18小时。

    1.2.3 蛋白质提取及定量：分别吸出培养瓶中细胞，PBS洗2次，离心弃上清，打散，加入等体积上样缓冲液，煮沸10分钟，－20℃冰箱保存备用。甲醇浸湿硝酸纤维素膜，蒸馏水冲洗，滤纸吸去多余水分。点加0.2μg/ml，1μg/ml，5μg/ml及10μg/ml标准蛋白液各1μl及点加待测样品各1μl于上述硝酸纤维素膜，室温干燥。胺基黑染膜1分钟，脱色液浸洗两次，待完全显色后与标准对比，判断样品蛋白含量。

    1.2.4 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳：每泳道加样量约为100μg，每个患者样本均按对照组、阿霉素组的次序加入两个泳道，剩余泳道用上样缓冲液平衡。电泳时间4小时。

    1.2.5 转膜：常规方法将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶电转移至硝酸纤维素膜上，时间2小时。

    1.2.6 染色、脱色及封闭：参照SIGMA公司胺基黑染液说明书进行。转膜后将膜取下，胺基黑染膜1分钟，脱色液浸洗两次，每次10分钟，待完全显色后用铅笔标记蛋白分子量的位置，在p53与p21之间将膜剪开。将剪开的膜用TBS液冲冼后用5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。

    1.2.7 抗体标记：p53单抗(Do－7,鼠抗人IgG2b)为DenmarkDAKOA/S公司产品，可与野生型及突变型p53反应，识别位点在多肽链的N－端。p21单抗(Anti－WAF1,Ab－1)为CALBIOCHEM公司产品。一抗p53(1∶200)，p21(1∶200)分别与对应的膜装入塑料袋中，赶气泡后37℃脱色摇床孵育2小时，定时翻动。TBS洗涤缓冲液洗膜2～3次，每次10分钟。二抗(辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG,1∶5000)与膜孵育2小时，TBS洗涤缓冲液洗2～3次，每次10分钟。

    1.2.8 ECL显影：参照ECL试剂盒说明书进行。

    2 结果

    2.1 p53基因功能检测结果判定方法[1]

    ①p53基因功能正常：对照组p53无表达或表达很低，p21有表达。阿霉素组p53及p21表达均较对照组增加；②p53基因突变致功能异常(突变型p53半衰期长)：对照组及阿霉素组p53均有高表达且两者间无差异。p21无表达或表达量很低且阿霉素组p21表达较对照组无增加；③可能因存在p53抑制因子或结合蛋白致其功能异常(p53本身为野生型)：阿霉素组p53表达较对照组明显增加，阿霉素组p21表达与对照组比较无变化；④存在不依赖p53的p21途径：阿霉素组比对照组p53表达无增加，而阿霉素组比对照组p21表达明显增加。

    2.2 结果判定6139

    2.2.1 正常人外周血标本：与结果①相符。

    2.2.2 细胞株：Fadu与结果②相符。HL－60对照组及阿霉素组均未见p53及p21蛋白表达。(图1)

   图1 WesternBlot显示CML细胞中p53及其对应p21表达。

    条带上数字为病例号，其后有A者代表阿霉素组，无A者代表对照组，F代表Fadu细胞株(阳性对照)，H代表HL－60细胞株(阴性对照)，M为标记的分子量(图2～4均相同表示)。可见第3、4例与Fadu类似，对照组及阿霉素组p53均为强表达而p21无表达或表达很低且两组间无差别，提示p53功能异常。HL－60对照组与阿霉素组p53及p21均无表达。

    2.2.3 CML病例：25例CML中，p53表达受阿霉素诱导的有21例，不受阿霉素影响的有4例，1例为加速期病人，3例为急变期病人。

    根据上述判断方法，25例CML中，与结果①相符的有20例，与结果②相符的有4例，与结果③相符的有1例(图1～4)。

   图2 第11、13两例对照组p53为低表达，诱导后p53及p21均明显增加，说明p53功能正常。第14例对照组及阿霉素组p53均为极强表达而p21无表达，提示p53功能异常。

   图3 Ⅰ为正常人标本(正常对照)，p53为低表达，诱导后p53及p21表达均增加，说明p53功能正常。第1、5、7例与Ⅰ类似。第6例阿霉素组比对照组p53表达明显增加但无相应的p21增加，其功能依然异常。

   图4 第21、22、23例对照组p53为低表达，诱导后p53及p21均明显增加，说明p53功能正常。第24例与阳性对照Fadu细胞株类似，对照组及阿霉素组p53均为强或极强表达而p21无表达，提示p53功能异常。

    2.2.4 p53基因功能检测结果与CML分期的关系见表1。从表中可看出p53基因功能异常者集中在CML疾病进展期(加速期和急变期)。14例慢性期CML病人p53基因均为野生型(其中一例丧失功能)，11例CML进展期病人(加速期和急变期)中4例为非野生型(突变型致功能异常)，x2检验P＜0.05，两者有统计学差异。

   表1 25例CML患者P53基因功能检测结果

    3 讨论 慢性粒细胞白血病p53基因异常多出现在原始细胞危象期，并且以髓系原始细胞危象最为常见[2～5]。既往常用的p53基因检测方法包括免疫组化法、PCR－SSCP及直接测序等。突变型p53蛋白因半衰期延长而在细胞内聚积[6]，因此以往一般认为用免疫组化法在肿瘤组织中检测到的p53均为突变型蛋白[7]提示预后差[8]。现已有许多实验结果表明免疫组化阳性并不一定代表存在基因突变[9]。而与多种因素有关，也可能因wtp53过量表达所致，已有实验结果显示wtp53在CML血细胞中有表达积累[10]。免疫组化阴性也并不一定代表p53基因正常。PCR－SSCP分析及直接测序通常用于检测p53基因的突变热点区，可能会遗漏部分热点区外的突变，而且即使p53基因本身是正常的，也不能保证其功能正常，从DNA复制、转录、翻译到p53蛋白作用于p21整个过程中任何一个环节出现问题均有可能导致p53功能丧失，因此需建立一种能直接反映p53基因功能状况的方法以指导临床治疗及进行预后判断。

    细胞DNA损伤时，p53蛋白量的表达会急剧升高，p21作为p53的下游中介者，执行p53的部分功能，导致G1期停滞，这一模型已得到共识。我们采用阿霉素做诱导剂，按0.2μg/ml的浓度将分离出的CML细胞体外培养18h，光镜下观察与未加阿霉素的对照组比较细胞形态无差异，WesternBlot结果显示21例阿霉素组p53表达量均较对照组有明显升高，说明所用阿霉素剂量能有效诱导wtp53蛋白的大量表达。其中20例阿霉素组p21的表达量也较对照组明显增加，两者是一致的趋势，表明细胞内p53基因为野生型，具有正常的功能，只有一例慢性期患者对照组p53表达量很低，阿霉素诱导后p53表达量显著增加，而p21表达量阿霉素组较对照组却无变化，因此推测本例患者虽然p53基因为野生型，可受DNA损伤剂的诱导，但可能存在p53抑制因子或结合蛋白，使其丧失了对p21的作用，显示其功能依然不正常。慢性期出现p53基因改变增加了基因组的不稳定性，可做为疾病恶性转化的指标之一。通过功能检测方法监测CML慢性期中的p53基因功能改变有助于早期发现不稳定因素，采取相应措施，有目的地进行针对性治疗，控制急变的发生。

    25例标本中，4例显示p53基因突变致功能异常，异常p53蛋白因半衰期延长而聚积，在DNA损伤剂的作用下不能增加表达及不能对p21的表达进行调控。4例p53基因功能异常者一例为加速期，在留取标本后一个月发生急粒变，另三例分别为CML急粒变，急单变和多克隆急变(留取标本时急粒变为主)。此4例患者经反复化疗均未能缓解，预后很差。本研究方法针对p53的功能直接进行检测，可多样本同时进行，在指导临床治疗、判断克隆演化、估计预后及监测移植后微小残留病等方面均有重要的意义。

    参考文献

    1 Zeng YX, Prabhu NS, Meng R, et al. Adenovirus－mediated p53 gene therapy in nasopharyngeal cancer [J] .International Journal of Oncology,1997,11：221.

    2 Gaidano G, Serra A, Guerrasio A, et al. Genetic analysis of p53 and RB1 tumor suppressor genes in blast crisis of chronic myeloid leukemia [J] .Ann Hematol,1994,68：3～7.

    3 Foti A, Ahuja HG, Allen SL, et al. Correlation between molecular and clinical events in the evolution of chronic myelocytic leukemia in blast crisis [J] . Blood,1991， 77(11)：2441～2444.

    4 Feinstein E, Cimino G, Gale RP, et al.p53 in chronic myelogenous leukemia in acute phase [J] .Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(14)：6293～6297.

    5 Ahuja H, Bar－Eli M, Arlin Z,et al. The spectrum of molecular alterations in the evolution of chronic myelocytic leukemia [J] .J Clin Invest,1991,87(6)：2042～2047.

    6 Finlay CA, Hinds PW, Levine AJ. The p53 proto－oncogene can act as a suppressor of transformation [J] .Cell,1989,57：1083～1093.

    7 Lepelley P,Preudhomme C, Vanrumbeke M, et al. Detection of p53 mutations in hematological malignancies：comparison between immunocytochemistry and DNA analysis [J] . Leukemia,1994,8(8)：1342～1349.

    8 Paydas S. p53 protein expression in leukemia [J] .Acta Oncol,1995,34(1)：23～26.

    9 何立珍，王少元，郭永军，等.白血病的p53基因研究[J].中华血液学杂志，1995，16(2)：69.

    10 Peller S,Yona R,Kopilova Y,et al. Molecular alteration in the TP53 gene of peripheral blood cells of patients with chronic myeloid leukemia [J] .Genes Chromosomes Cancer,1998,21(1)：2～7.

   收稿日期：1998－08－25；修回日期：1999－03－18