急性淋巴细胞白血病p16基因及P16蛋白失活与临床相关性的研究

   急性淋巴细胞白血病p16基因及P16蛋白失活与临床相关性的研究

   中华儿科杂志 2000年第10期第38卷 论著

   作者：朱易萍 廖清奎 李钦伯 罗春华 杨崇礼 杨先军 李丰益

   单位：朱易萍（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）；廖清奎（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）；李钦伯（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）；罗春华（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）；杨崇礼（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）

   关键词：白血病，淋巴细胞性，急性；基因，P16；基因缺失；蛋白质P16

    【摘要】 目的 探讨p16基因、蛋白失活在小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）中的临床意义。方法应用免疫细胞化学方法检测52例初治小儿ALL P16蛋白的表达水平。差异PCR技术检测42例初治小儿ALL p16基因的纯合缺失。结果 p16基因总的纯合缺失率38%（16/42），p16基因缺失与T系表型、高白细胞总数（＞25×109/L）、高肿瘤负荷、髓外浸润等影响预后的高危临床特征显著相关。高危型ALL p16基因缺失率（67%）远高于标危型ALL（10%），P＜0.01。在预后好者中，p16基因纯合缺失率为10%（2/19）；在预后差者中，p16基因纯合缺失率为54%（6/11），二组差异有显著性，P＜0.05。P16蛋白表达缺失率为58%(30/52)，P16蛋白缺失者除多见髓外浸润外，与其它临床高危因素及预后无关。结论 p16基因、蛋白失活在小儿ALL的发病过程中起重要作用。 p16基因缺失者预后不良，与ALL复发可能有关，可作为评估预后，指导治疗的指标之一。

   The expression of P16 protein in childhood acute lymphoblastic leukemia

   ZHU Yiping LIAO Qingkui LI Qinbo

    （Second Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China）

    【Abstract】 Objective The tumor suppressor gene p16 mapped at 9p21. as a negative regulatory protein of cell cycle plays a role in inhibition of cell division and proliferation. Recently, it has been reported that the homozygous deletion of p16 gene was much higher in childhood acute lymphoblastic leukemia(ALL), especially in T-ALL, than other types of leukemia. But it is difficult to find the abnormalities of the gene regulation sequence with the ordinary molecular biological techniques. Study on protein activity could finally reflect gene function in tumor cells. Thereafter, we detected the expression of P16 protein, and explored the relationship with immunophenotypes in childhood ALL and the significance in the pathogenesis of ALL.Methods Fifty-two recently diagnosed childhood ALL patients aged from 1 year 2 months to 14 years including 31 boys and 21 girls were selected as experiment group. Twenty healthy children aged from 2 months to 9 years, 13 boys and 7 girls, were in the control group. The patients included 10 T-ALL, 9 early pre-B ALL, 14 C-ALL, 4 pre-B ALL, and 4 B-cell ALL. The biotin-streptavidin method was used to detect the P16 protein. Cell samples were pre-incubated with hydrogen peroxide (3%) for 20 min at room temperature, and with non-immune goat serum (10%) for 20 min at 37℃. Primary antibodies (polyclonal antibody, Santa Crue, dilution 1:50) were applied and incubated for 12hr at 4℃. The secondary antibodies were biotinylated goat anti-rabbit IgG (1∶50 dilution)and incubated for 30 min at 37℃, after that the streptavidin-biotinylated-peroxidase (SP) complex (dilution 1:200, 30 min, 37℃) was added. Finally, peroxidase activity was visualized by adding DAB, which formed a yellowish-brown product, counterstain was performed with hematoxylin. The staining was graded as negative (-), weakly positive (+), positive(++) and strongly positive (+++).Results The positive expression rate of P16 protein in childhood ALL patients was 42%, obviously lower than that in normal group (95%, P＜0.001). The lower level expression (+) of P16 protein in normal group was 80%, while in ALL, the ratio of strongly positive (+++) over positive expressions was 73% (16/22), the ratio of weak positive (+) over positive expression was 5% (1/22). The deletion of P16 protein expression was found in 8/10 of T-lineage ALL (80%) and in 18/31 of B-lineage ALL (58%) patients, respectively (P＞0.05). In the subtype of B-lineage ALL, the deletion of P16 protein expression occurred in 3/9 of early pre-B ALL (33%), 7/14 of C-ALL (50%), 4/4 of pre-B ALL (100%) and 4/4 of B-cell ALL (100%) . The degree of P16 protein expression in pre-B ALL and B-cell was lower than that in pre-B ALL and C-ALL by Ridit analysis. The strong positive expression of P16 protein was revealed in 77% of B-lineage ALL.Conclusion The P16 inactivation could suppress the function of G1/S checkpoint in cell cycle, which plays a very important role in the leukemogenesis and progression of leukemia. The enhanced expression of P16 protein may also be related to the leukemogenesis in some groups of B-lineage ALL by via inhibition of apotosis; in contrast, P16 inactivation which results in the higher proliferative activity may be associated closely with the development of cancer in T-lineage ALL.

    【Key words】 Leukemia, lympholcytic, acute;Genes p16; protein P16;Gene deletion

    p16基因是1994年克隆和定位于染色体9p21的抑癌基因，野生型P16蛋白在细胞周期调控途径中起抑制作用［1］。早在p16基因发现以前，人们已注意到急性淋巴细胞白血病（ALL）染色体9p21的畸变与某些临床高危因素有关。由于p16基因是9p21异常的靶基因之一，其改变与临床表现及预后的关系已引起广泛关注。但因样本量少，随访期短，各家研究结论不一，国内未见报道。我们在检测了42例小儿ALL p16基因的纯合缺失与52例P16蛋白表达状况的基础上，分析了p16基因、蛋白失活与临床高危特征及预后的关系。

    对象和方法

    一、 对象

    1997年5月～1999年1月在本院儿科门诊和病房收治的初治ALL患儿。P16蛋白检测者52例，男31例，女21例；年龄1.2～14岁，中位年龄6.5岁。复发病例3例，均为男性，年龄7～9岁。p16基因检测者42例，男27例，女15例；年龄2～14岁，中位年龄6岁。经FAB形态学确诊。对44例作了免疫学分型，其中T-ALL 10例，早期前B型ALL (early pre B-ALL) 9例 ，普通型ALL(C-ALL) 14 例，前B型ALL (PreB-ALL) 4例，B-ALL 4例，杂合性白血病3例(T、B双表型1例，淋粒双表型2例)。对照组取非白血病且骨髓象正常者骨髓20份。

    二、方法

    1. P16蛋白测定：采用常规SP免疫组化染色法。标本置3% H2O2室温处理20 min，依次加10%羊血清，I抗（兔抗人P16多克隆抗体，1∶50稀释，Santa Cruz产品），生物素标记II抗（1∶200稀释）及SP复合物（1∶200稀释），滴加DAB显色液，苏木素复染。以淋巴瘤阳性片为阳性对照，以PBS液代替I抗为阴性对照。阳性染色呈棕黄色细颗粒状，分布于细胞核或细胞浆上。油镜下计数至少500个白血病细胞， 阳性细胞数＜5%为（-）；5%～25%为（+）；＞25%～50%为（++）；＞50%为强阳性（+++）。

    2. p16基因分析: (1) 提取DNA：酚-氯仿法。用TE液溶解，调整浓度为0.1 μg/μl。(2) 差异PCR检测p16基因缺失：P16目的基因与β-珠蛋白内参照基因在同一试管内扩增，通过图像分析，得出二者的比率，判断结果。

    引物(美国生命技术公司生产)［2］：外显子1 上游引物：5′-GGGAGCAGCATGGAGCCG-3′，下游引物： 5′-AGTCGCCCGCCATCCCCT-3′，扩增片段长度为204 bp；外显子2 上游引物： 5′-AGGTCATGATGATGG-GCAG-3′，下游引物 5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCT-3′，扩增片段长度为320 bp； β-珠蛋白基因上游引物：5′-GCACTGACCTCCCACATTC-3′， 下游引物：5′-TATC-ATGCCTCTTTGCACCATTC-3′ 扩增片段长度为527 bp。

    操作： 在25 μl反应体系中加入P16外显子1或外显子2，引物各0.5 μmol/L，β-珠蛋白引物各0.3 μmol/L，10×dNTP 250 μmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.6 mmol/L，Taq酶1.5U，模板DNA 100 ng。反应条件：95℃预变性5 min，95℃、1 min；60℃ 45 s （外显子1），58℃ 45 s （外显子2）；72℃ 45 s，循环30次；72℃延伸10 min。电泳：取PCR扩增产物10 μl，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，80 V、30 min，缓冲液0.5×TBE。EB染色，凝胶图像分析仪照像并分析。阳性对照：正常小儿外周血单个核细胞。阴性对照：含p16基因纯合缺失的K562细胞株。结果判定：计算P16/β-珠蛋白基因扩增量测定值（峰面积）比值。无p16基因扩增带或P16/β-珠蛋白比值＜20%（低于该患儿标本正常细胞百分数），确定为p16基因纯合缺失［2］。7720

    三、临床资料

    1. 临床分型：根据发病年龄、临床特点及实验室检查结果分为高危和标危两型。总积分＜3分者为标危型，≥3分者为高危型。

    2. 髓外浸润：有如下之一者为阳性：(1)肝和(或)脾肿大＞5 cm；(2)中枢神经系统白血病；(3)纵膈肿块；(4)睾丸白血病。

    3. 白血病细胞负荷危险因素评分（risk factor RF）［3］：RF=0.2×log（外周血白血病细胞数/μl+1）×0.06×肝脏肋下大小（cm）+0.04×脾脏肋下大小（cm）。

    4.化学治疗：标危型采用VDLD（长春新碱，柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、地塞米松）方案（28 d）诱导缓解， VCR(V，长春新碱)1周1次，共4次。DNR(D，柔红霉等)共2次。L-ASP(L，左旋门冬酰氨酶)共8次。DEX(D，地塞米松)第1天～22天。 高危型采用CODPL（环磷酰胺，长春新碱，柔红霉素，地塞米松，左旋门冬酰胺酶）方案诱导缓解，在VDLD方案基础上加用CTX(C，环磷酰胺)1次。两型均用EA（鬼臼乙叉甙，阿糖胞苷）方案巩固1疗程（共用3次）。大剂量MTX（氨甲蝶呤）庇护所预防3个疗程（10 d为1疗程），MTX+6MP （6巯基嘌呤）维持，每月强化1次。并随访半年以上，将化疗四周内骨髓未缓解，死亡及诱导缓解后半年内复发者均列为预后差者，反之为预后好者。

    四、数据处理 SPSS统计软件处理。χ2检验、校正χ2检验、精确概率法计算。

    结果

    一、p16基因纯合缺失

    在 42例初治小儿ALL中，p16基因总的纯合缺失率为38%（16/42），其中11例同时缺失外显子1和外显子2，5例为单一的外显子2缺失。T系ALL中p16基因纯合缺失率占80%（8/10），B系ALL占22%（7/31），二者差异有显著性，χ2=8.412 ，P＜0.01。B系各亚型中p16基因纯合缺失以前B-ALL相对多见（25%），以C-ALL型相对少见（14%）。

    二、P16蛋白缺失

    在52例初治ALL，P16蛋白缺失率为58%（30/52）。P16蛋白阳性率为42%，明显低于正常对照95%（19/20），χ2=16.357，P＜0.01。3例淋巴肉瘤白血病及3例骨髓复发者均无P16蛋白表达。T系ALL与B系ALL P16蛋白表达缺失率分别为80%（8/10）和58%（18/31），无统计学意义，χ2=1.568（P＞0.05）。

    三、p16基因纯合缺失与临床指标的相关性

    p16基因缺失除与性别、年龄无关外，经χ2检验，与临床高危指标及预后均有相关性(表1)。

    四、P16蛋白缺失与临床指标相关性

    经χ2检验，P16蛋白缺失与髓外浸润有关（大多为肝脾肿大），与其他临床高危指标及预后无明显关系(表2)。

   表1 p16基因缺失与临床特征的关系

    数 P16

    (-) P16

    (+) 缺失率

    (%) χ2 性别 男

   27

   10

   17

   37

   0.035 女 15 6 9 40 年龄 2～10岁 32 10 22 31 1.50△ ＞10岁 8 5 3 62 WBC数 ＜25×109/L 25 5 20 20 8.575**△ ??25×109/L 17 11 6 65 髓外浸润 + 18 11 7 61 7.080**△ - 24 5 19 21 临床分型 高危 21 14 7 67 14.553**△ 标危 21 2 19 10 RF 0.8～1.2 25 6 19 24 5.20* ＞1.2～1.7 17 10 7 59 预后 好 19 2 17 10 4.833*△ 差 11 6 5 54

    *P＜0.05 **P＜0. 01 △为校正χ2值

   表2 P16蛋白缺失与临床特征的关系

    数 P16

    (-) P16

    (+) 缺失率

    (%) χ2 性别 男

   31

   20

   11

   64

   1.464 女 21 10 11 48 年龄 2～10岁 42 23 19 55 0.452* ＞10岁 8 6 2 75 WBC数 ＜25×109/L 32 16 16 50 2.017 ≥25×109/L 20 14 6 70 髓外浸润 + 23 17 6 74 4.448** - 29 13 16 45 临床分型 高危 27 18 9 67 1.856 标危 25 12 13 48 RF 0.8～1.2 35 18 17 51 1.725 ＞1.2～1.7 17 12 5 71 预后 好 18 7 11 39 1.388 差 17 10 7 59

    *为校正χ2值 **＜0.05

   讨论

    我们对小儿ALL各临床指标与p16基因缺失的相关性进行了分析，表明p16基因缺失与白细胞总数＞25×109/L（一半以上＞50×109/L）、伴髓外浸润（纵膈肿块，肝脾肿大为主）、高肿瘤细胞负荷、T系表型等影响预后的高危临床特征有关。高危型ALL p16基因缺失率（67%）远高于标危型患儿（10%），P＜0.01。在预后差的11例中，p16基因缺失者为6例，占55%；在预后好的19例中。p16基因缺失者2例，占10%，p16基因缺失者多分布于预后差的组中，P＜0.05。8例接受正规治疗的p16基因缺失者，4例因中枢神经系统白血病（CNSL）在半年内复发，2例因出血和感染死于诱导治疗期；而22例同期接受治疗的p16基因非缺失者无一例复发，有2例死于感染。本研究提示p16基因缺失代表了不良的预后因素，与小儿ALL的复发可能有关。p16基因缺失在C-ALL型相对少见也提示与预后有关。

    由于p16基因缺失者多见于T系ALL，而T系ALL常与高危因素相伴，故p16基因缺失者预后差是否由T系表型所致，值得注意。Diccianni等［4］对比分析了103例小儿T系ALL p16基因缺失者与非缺失者后认为p16基因缺失的T系ALL复发后生存期明显缩短，推测p16基因缺失加之T系表型促进了肿瘤细胞的增殖和恶化。Kees等［5］随访小儿 ALL 4年以上，结果表明p16基因缺失组的复发率与死亡率明显高于非缺失组，并提出p16基因缺失是评估小儿ALL复发与死亡的重要预后因素。目前复发是小儿ALL治疗失败的主要原因，因此将p16基因缺失作为判断预后、指导治疗的指标，具有一定的临床意义。

    通过分析P16蛋白缺失与临床的相关性，发现蛋白缺失与性别、年龄、白细胞总数、肿瘤细胞负荷等因素均无显著性相关，在高危型与标危型之间也无明显差异，仅多见于髓外浸润（以肝脾肿大为主）。在预后好和预后差的患者之间，P16蛋白缺失率差异亦无显著性。但3例处于(BM)复发期的病例均无P16蛋白表达，其中2例在复发后10个月及12个月死亡，3例由非霍奇金淋巴瘤(NHL)转变的淋巴肉瘤白血病患者也无蛋白表达，提示P16蛋白缺失可能与复发及疾病进展有一定关系，鉴于复发期病例少，有待进一步研究。由于小儿ALL P16阳性者的蛋白表达水平不一，我们应用免疫细胞化学方法，不能准确定量分析，因此难以确定不同的蛋白表达量与临床预后的相关性。Mekki等［6］采用Western blot方法研究58例小儿ALL，蛋白高表达者（大于均数）的无病生存期显著缩短，其次为蛋白阴性者，蛋白弱表达者（0与均数之间）则预后最好。本研究发现P16蛋白表达与影响预后的临床高危因素无明显关系，可能由不同病例的预后异质性所致。此外，由于样本例数少，不能对临床及生物学特征不同的ALL各亚型单独分析总结。还有待积累更多的病例，延长随访时间，应用定量方法，以获得更可信的结论。

    作者单位：杨先军（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）

    李丰益（610041 成都，华西医科大学附属第二医院 儿科）

   参考文献

    1，Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldnaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264: 436-440.

    2，Faienza MF, Ragione FD, Rasso G, et al. P16 INK4A gene homozygous deletions in human acute leukemias with alterations of chromosome 9. Br J Hematol, 1996, 93: 632-636.

    3，Keiter A, Schrappe M, Ludwig WD, et al. Chemotherpy in 998 unselected childhood acute lymphoblastic leukemia patients. Results and conclusions of the multicenter trial ALL-BEM 86. Blood, 1994, 84: 3122-3133.

    4，Diccianni MB, Batova A, Yu J, et al. Shortened survival after relapse in T-cell acute lymphoblastic leukemia patients with P16/p15 deletions. Leukemia Res, 1997, 21: 459-558.

    5，Kees VR, Burton PR, Lu C, et al. Homozygous deletion of the P16/MTS1 gene in pediatric acute lymphoblastic leukemia is associated with unfavorable clinical outcome. Blood, 1997, 89: 4161-4166.

    6，Mekki Y, Catallo R, Bertrand Y, et al. Enhanced expression of P16 ink4a is associated with a poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 1999, 13: 181-189.

   收稿日期：1999-08-30