婴儿急性白血病的临床和分子生物学特点

   婴儿急性白血病的临床和分子生物学特点

   中华血液学杂志 2000年第7期第21卷 论著

   作者：顾龙君 马志贵 董硕 Chiwai So Liehaug Chan 况少青 童宇红 薛惠良

   单位：顾龙君（200092 上海第二医科大学附属新华医院）；马志贵（200092 上海第二医科大学附属新华医院）；董硕（上海血液学研究所）；Chiwai So（香港大学玛利医院）；Liehaug Chan（香港大学玛利医院）；况少青（上海血液学研究所）；童宇红（200092 上海第二医科大学附属新华医院）；薛惠良（200092 上海第二医科大学附属新华医院）

   关键词：白血病；婴儿；染色体；基因，HRX

    【摘要】 目的 对2岁以下的婴儿急性白血病作临床和分子生物学特点的研究。方法 用R带和(或)G带分带技术进行核型分析，DNA印迹法检测HRX重排，聚合酶链反应和逆转录-聚合酶链反应进行融合基因检测。结果 20例患者经检测后其中10例有HRX基因重排，该10例作融合基因检测，5例是AF-4/HRX，2例是AF-9/HRX，1例是HRX/ENL，1例是HRX自我融合，1例是未曾报告过的命名为HRX/EEN的融合基因。结论 婴儿急性白血病有高发的HRX基因重排，尤其以形成AF-4/HRX融合基因更多见（50％），这对指导临床治疗和进一步的病因学研究有重要意义。

   Study on clinical and molecular biological characteristics of infant acute leukemia

   GU Longjun, MA Zhigui, DONG Shuo, et al.

    （Xinhua Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Hematology, Shanghai 200092，China）

    【Abstract】 Objective To study the clinical and molecular biological characteristics of infant acute leukemia (IAL). Methods R and/or G banding technique was used for analysis of karyotype. DNA blotting for HRX gene rearrangement, and polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcriptase PCR (RT-PCR) for fusion gene detection. Results Twenty cases of IAL were detected. HRX gene rearrangement was found in 10 cases, including HRX/AF-4 fusion gene in 5, HRX/AF-9 fusion in 2, and HRX/ENL fusion in 1, HRX self-fusion mediated by alu-repeat homologous recombination and HRX/EEN fusion each in one (HRX/EEN is a novel fusion gene reported for the first time). Conclusion High frequency of HRX gene rearrangement occured in IAL,which is characterised by a massive leukemia cell burden and 11q23 translocation, forming fusion genes, especially HRX/AF-4 (about 50%). The results are of important significance in guiding clinical treatment and approaching the etiology of IAL.

    【Key word】 Leukemia; Infant； Chromosome; Gene，HRX

    在婴儿急性白血病(IAL)中，涉及染色体11q23的易位和内缺失非常多见，在18个月以下的IAL中发生率可高达75％。进一步研究发现，染色体11q23上存在着一个与急性白血病(AL)发生相关的重要基因，它和果蝇的Trithorax(三胸)基因有较高的同源性，故命名为HRX(Homolog of Drosophila Trithorax)基因［1］。分子生物学研究提示11q23上几乎所有的断裂点都集中在HRX基因的一个狭窄区域内，和11q23发生易位的区域至少有10个，其中以4q21，9p22和19p13最为常见，分别形成t(4;11)(q21;q23)，t(9;11)(p22;q23)和t(11;19)(q23;p13)［2］，它们在IAL的病因学、临床表现及生物学特点方面起着重要作用，并形成IAL的分子生物学的

    特征。我们就IAL的临床和分子生物学特点进行了研究，现报告如下。

    病例和方法

    1 病例 1994年1月～1996年12月我们共收治儿童急性白血病168例，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）96例，急性髓系白血病（AML）72例，2岁以下的IAL 24例，其中男10例，女14例，年龄3～24个月；ALL 11例(L1 5例，L2 6例)，AML 13例(M2 3例，M3 2例，M4 3例，M5 4例和M6 1例）。诊断IAL时的外周血白细胞计数是(3.2～167.0)×109/L，平均44.9×109/L（表1）。

   表1 24例婴儿急性白血病的临床、血液学及分子生物学表现

    号 性

    别 年龄

    (月) 诊断时WBC

    (×109/L) 肝/脾

    (cm) 诊断时

    CNSL FAB

    分型 免疫

    表型 染色体

    核型 DNA印迹 融合基因 转归 BamHⅠ EcoRⅠ SacⅠ 1 女 16 63.3 5/5 - M5 髓系 低二倍体 G R R AF-9/HRX CCR＞70个月 2 男 16 156.0 6/8 + M2 髓系 无分裂象 R R R AF-8/HRX 发病2周成

    绿色瘤，

    死亡 3 女 16 12.1 5/4 - L1 R G G HRX/ENL CCR＞34个月 4 男 18 3.8 6/8 - L1 AUL 46XY G R G AF-4/HRX CCR＞34个月 5 女 5 78.4 5.5/5.5 - L1 AUL 无分裂象 R G G AF-4/HRX CCR 2个月

    后复发死亡 6 女 22 113.5 4/2 - M3 髓系 47XX,+21 R G R HRX/EEN CCR＞27个月 7 女 22 5.9 3/2.5 + M4 高二倍体 R R R HRX自身融合 放弃治疗，

    死亡 8 男 20 24.3 5/3 - M5 髓系 无分裂象 G G G - 放弃治疗，

    死亡 9 男 3 70.3 6/7 - M2 无分裂象 G G G - 放弃治疗，

    死亡 10 女 9 20.3 5/4 - L2 AUL 低二倍体 G G G - 放弃治疗，

    死亡 11 女 17 7.6 3/3 - L3 高二倍体 G G G - CCR＞52个月 12 女 24 3.2 3/2 - L2 B-Ⅲ 低二倍体 G G G - CCR＞44个月 13 男 20 19.2 1/0.5 - L1 B-Ⅱ 46XY G G G - CCR＞27个月 14 女 13 56.8 6/4 - M2 髓系 G G G - 放弃治疗，

    死亡 15 男 4 64.3 7/7 + L2 G G G - 放弃治疗，

    死亡 16 男 9 32.8 4/5 - L2 放弃治疗，

    死亡 17 女 9 167.0 7/8 - M5 髓系 无分裂象 R R G AF-4/HRX CCR＞12个月 18 女 22 4.2 2/3 - L2 B-Ⅲ 生长不良 G G G CCR＞11个月 19 男 13 21.7 3/3 - M5 髓系 生长不良 放弃治疗，

    死亡 20 女 12 18.6 4/3.5 - M4 髓系 44XX 放弃治疗，

    死亡 21 女 9 28.7 5/4 - M3 44XX 放弃治疗，

    死亡 22 男 23 12.5 3/2 - M4 髓系 47XY,+22 R G R AF-4/HRX 放弃治疗，

    死亡 23 女 3 68.7 4/5.5 + L1 B-Ⅳ 生长不良 R R R 放弃治疗，

    死亡 24 男 17 24.7 5/4 - M6 髓系 44XY G G G AF-4/HRX 放弃治疗，

    死亡

    注:肝/脾(cm)系肋缘下肝脾的厘米数；G：胚系构型；R：重排； 髓系：CD13(+)和（或）CD33(+)、CD14(+)；CCR：持续完全缓解2 标本 取患儿骨髓，用Ficoll液分离单个核细胞并在液氮中保存，作免疫表型和HRX基因检测，部分新鲜细胞经24h培养，按标准方法作染色体核型分析。

    3 免疫表型和细胞遗传学分析 所用单克隆抗体包括HLA-DR、CD19、CD10、CD20、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD13、CD14、CD33和CD34(BD公司产品)，用流式细胞仪（BD公司）通过间接或直接免疫荧光法检测标本的免疫表型。新鲜细胞培养24h，收集有丝分裂中期细胞，用R带和(或)G带分带技术按照国际细胞遗传学命名协会（ISCN）方法进行核型分析。6139

    4 DNA印迹分析 用常规方法抽取白血病细胞DNA，分别用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和SacⅠ酶解，在7g/L琼脂糖凝胶中电泳分离并以Southern方法转移在尼龙薄膜上，然后用HRX基因探针P/S4作分子杂交，置-80℃，5～14d后放射自显影［3］。

    5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、巢式PCR检测融合基因 参考文献［4］方法。

    6 检测新基因方法 详见参考文献［5,6］。

    结果

    1 IAL分布状况 在3年期间收治的168例儿童急性白血病中IAL 24例，IAL占儿童急性白血病总数的14.3％,其中ALL 11例，占收治的96例ALL的11.5%，AML 13例，占收治的72例AML的18.0%。

    2 临床结果 24例IAL中13例在诊断后放弃治疗，短期内死亡，例2（M2）在病程仅2周时即发展成绿色瘤，于发病的第14天死于全身广泛浸润、出血和全身衰竭；例5在持续完全缓解（CCR）2个月后复发，再诱导又获完全缓解（CR），1个月后再次复发死亡。其余9例目前均处于CR中。10例有HRX基因重排的IAL中3例放弃治疗死亡，2例（例2，5）治疗无效短期死亡，5例存活，其中1例CCR＞24个月，2例（例3，4）CCR＞34个月，1例（例6）CCR＞26个月，1例（例1）M5已CCR＞70个月（表1）。

    24例IAL诊断时白血病细胞负荷较高，外周血WBC (3.2～167.0)×109/L（平均44.9×109/L）；24例IAL肝和(或)脾增大，肋缘下≥5cm者15例;诊断时即表现有中枢神经系统白血病者4例(16.7%)，明显高于非IAL的急性白血病群体。

    3 免疫表型 24例IAL中细胞形态学为AML的13例，其中10例作免疫表型分析者均表现为髓系白血病（表1），11例ALL中7例作免疫表型分析，3例（例4，5，10）对测试的所有单克隆抗体均无阳性反应，故属急性未分化型白血病（AUL）。1例（例23）属B-Ⅳ型，2例（例12，18）属B-Ⅲ型,1例(例13)属BⅡ型。

    4 细胞遗传学分析 对20例IAL患儿进行染色体核型分析，3例细胞培养生长不良，5例无分裂象，2例46XY，其余10例均表现为数量异常，超二倍体者4例，低二倍体者6例，未发现有11q23的构型异常，4例未测定（表1）。

    5 HRX相关的融合基因分析结果

    5.1 HRX基因重排：对20例患儿白血病细胞进行DNA印迹分析，发现10例有HRX重排（表1）。

    5.2 融合基因：用自行设计的引物对10例HRX基因重排的IAL患儿白血病细胞进行融合基因的检测，8例患儿可见融合基因产物。AF-4/HRX 5例，AF-9/HRX 2例，HRX/ENL 1例。

    5.3 新发现的融合基因：我们对10例有HRX重排的标本进行融合基因检测，2例用上述三个体系（AF-4/HRX，AF-9/HRX和HRX/ENL）引物未能探测到相应的融合基因，经深入研究，结果发现1例（例7，M4）是由Alu重复顺序同源重排介导的HRX基因自身融合；1例（例6，M3）在染色体19p13上有一个未曾报告的新基因，命名为EEN基因，形成的融合基因为HRX/EEN。

    5.4 用AF-4/HRX和HRX/ENL作标志检测微量残留病(MRD)：我们用AF-4/HRX和HRX/ENL融合基因作为白血病特异的分子标志分别对例4和例3作CR后MRD检测，结果发现他们在CR后1～6个月内MRD为阳性，但在早期连续强烈化疗后CCR 10个月时MRD均转为阴性，至今他们已无病生存＞34个月，似处于稳定的CR状态。

    用慢性粒细胞白血病的细胞总DNA为稀释剂，对2种易位标本RNA进行1∶10连续稀释，作灵敏度测定，结果其灵敏度在t（11;19）者为10-4，在t（4;11）者为10-5。

    讨论

    2岁以内的IAL分子生物学的特点是有高比率的11q23异常，t（4;11）多见于婴儿ALL，1岁以内发生率为50％，6个月以内发生率高达75％；t（9;11）则常见于婴儿AML，且常累及单核细胞系，较多表现在M4和M5亚型。并在11q23有HRX基因重排，本组检测的20例中发现10例有HRX基因重排。在儿童白血病中，IAL占14.3％，美国St.Jude儿童研究医院报告，婴儿ALL占儿童ALL的2.5％，婴儿AML则占儿童AML的9.3％，我们的研究结果则分别是11.5％和18.0％，较他们报告的百分率要高。IAL患者，尤其是HRX基因重排者的临床特点是：肿瘤负荷大，外周血白细胞计数较高，肝脾肿大及中枢神经系统浸润明显，预后较差。在本组病例中上述表现明显。

    本组10例HRX重排的患婴中5例有AF-4/HRX融合基因，2例有AF-9/HRX融合基因，1例有HRX/ENL融合基因，1例有HRX/EEN融合基因，EEN基因是一未曾发现的、在19p13上的新基因［6］，今后我们将对其进行克隆和测序。另1例是由Alu重复顺序同源重排介导的HRX基因自身融合，这是在M4和M5中的常见亚型，有较好的预后［5］。有HRX重排而未探到融合基因者，尚可能有未曾报告过的新融合基因，应予以关注。

    HRX基因重排的不同亚型有不同的预后，t（4;11）是ALL的不良预后因素，检测11q23异常和HRX基因重排对于判断预后、指导治疗有重要的意义。因此，对IAL除了作MIC分型检查外，染色体核型未能检测到11q23异常者，应进一步用分子生物学方法检测HRX基因重排。本组10例HRX基因重排者，没有发现11q23染色体核型异常。

    有HRX基因重排的IAL患者，可用相关的融合基因作分子标志检测其CR后的MRD，其灵敏度在10-4左右。这为寻找MRD检测的标志和方法提供了有用的线索

    基金项目：国家自然科学基金资助项目（39470317）；上海市自然科学基金资助项目(94-CG03)

   参 考 文 献

    1，Raimondi SC, Peiper SC, Kitchingman GR, et al, Childhood acute lymphoblastic leukemia with chromosomal breakpoints at 11q23. Blood, 1989,73:1627-1633.

    2，Chen CS, Sorensen PHB, Domer PH, et al, Molecular rearrangements on chromosome 11q23 predominate in infant acute lymphoblastic leukemia and are associated with specific biologic variables and poor outcome. Blood, 1993,81:2368-2373.

    3，顾龙君, 马志贵, 李筱骏,等. 婴儿急性白血病HRX基因重排及其意义. 中华儿科杂志, 1995,33:261-263.

    4，马志贵, 董硕, 黄秋花,等. HRX基因重排的研究. 中华血液学杂志, 1996,17:1-4.

    5，So CW, Ma ZG, Price CM, et al. MLL self fusion mediated by Alu repeat homologous recombination and prognosis of AML-M4/M5 subtypes. Cancer Res, 1997,57:117-122.

    6，So CW, Caldas C, Liu MM, et al. EEN encodes for a member of a new family of proteins containing an Src homology 3 domain and is the third gene located on chromosome 19p13 that fuses to MLL in human leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997,94:2563-2568.

   (收稿日期：1999-10-18)