聚合酶链反应方法检测急性白血病p15基因高度甲基化

   聚合酶链反应方法检测急性白血病p15基因高度甲基化

   中华血液学杂志 2000年第5期第21卷 论著

   作者：陈飞 曾宪昌

   单位：430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院血液科

   关键词：基因，p15；甲基化，高度；白血病，急性；聚合酶链反应

    【摘要】 目的 探讨p15基因高度甲基化在急性白血病发病中的作用。方法 用甲基化敏感的限制性核酸内切酶消化结合聚合酶链反应技术。结果 在36例急性白血病患者中有22例（61.1%）存在p15基因高度甲基化，其中26例急性非淋巴细胞白血病（ANLL）有17例（65.4%），10例急性淋巴细胞白血病有5例（50.0%）存在p15基因高度甲基化。结合临床资料分析，有p15基因甲基化的ANLL患者有较高的外周血白细胞计数（P＜0.05）及骨髓原始、（早）幼细胞百分比（P＜0.01）。结论 p15基因高度甲基化在急性白血病中较为常见，其功能失活可能与部分急性白血病的发生有关。

   Detection of hypermethylation of p15 gene in patients with acute leukemia by polymerase chain reaction

   CHEN Fei,ZENG Xianchang.

    (Department of Hematology,the Second Affiliated Hospital,Hubei Medical University,Wuhan 430071，China)

    【Abstract】 Objective To explore the role of hypermethylation of p15 gene in the pathogenesis of acute leukemias.Methods DNA from 36 cases of acute leukemia were investigated using restriction enzyme digestion combined with polymerase chain reaction(PCR) technique.Results Hypermethylations of p15 gene were found in 22 (61.1%) patients,including 17 cases of acute non-lymphoblastic leukemia(ANLL) and 5 of acute lymphoblastic leukemia (ALL).ANLL patients exhibited p15 gene hypermethylations had higher WBC in peripheral blood (P＜0.05) and higher percentages of leukemia cells in bone marrow(P＜0.01).Conclusion Inactivation of p15 gene due to hypermethylation may be involved in the pathogenesis of some acute leukemias.

    【Key words】 Gene,p15; Hypermethylation； Leukemia,acute； Polymerase chain reaction

    p15基因定位于人类染色体9p21，是近几年发现的一种新的肿瘤抑制基因，常通过缺失而在多种人类恶性肿瘤中失活［1］。在恶性血液病中其缺失主要见于急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）［2］。最近的研究表明，位于p15基因启动子及转录起始区域内的CpG岛高度甲基化是导致该基因失活的另一重要方式［3］。为探索p15基因在急性白血病发病中的作用，我们应用甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ酶切，结合聚合酶链反应(PCR)扩增，检测了包含CpG岛的p15基因外显子1在36例急性白血病患者中的甲基化状态，并分析了p15基因甲基化的急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者的临床特点。

   病例和方法

    1 病例及标本DNA的提取 急性白血病患者36例，其中男22例，女14例，年龄20～75岁。其中ANLL 26例（M18例，M25例，M36例，M44例，M52例，M61例），ALL 10例。标本取自患者的骨髓或外周血。10名正常对照为健康志愿献髓者或献血者。

    细胞基因组DNA的提取按常规的蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇抽提，无水乙醇沉淀的方法，测各样品DNA溶液吸光度(A)，计算A260/A280，比值均高于1.7。

    2 限制性内切酶消化 取上述DNA 1μg，限制性内切酶HpaⅡ10～20U及酶切缓冲液2μl，组成20μl酶切反应体系，37℃水浴过夜，以求过量消化DNA。

    3 PCR扩增反应 根据Jen等设计的引物序列［4］，合成下列二条引物：上游引物p15-1F 5′-CCAGAAGCAATCCAGGCGCG-3′，下游引物p15-1R 5′-AATGCACACACCTCGCCAACG-3′，扩增片段长度为532bp，含p15基因外显子1。引物由上海生工生物工程公司合成。包含CpG岛的p15基因外显子1如图1所示。设置20μl反应体系，含10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol／L MgCl2,引物各0.6μmol／L，125μmol／L dNTP，Taq酶1.25U,模板DNA 200ng。反应条件：首次变性95℃ 5min，然后95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个循环，最后72℃延伸5min。

   p15-1F、p15-1R分别为上、下游引物对应位置；↓为限制性内切酶HpaⅡ识别位点

   1 p15基因外显子1示意图

    4 结果判断 取PCR反应后扩增产物10μl，EB染色，20g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，PCR Markers 为DNA分子量标准，将泳动位置与预期片段长度相符合的特异性产物判断为阳性。每批反应均设置正常及空白对照。

    5 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验及四格表确切概率法检验。4155

   结 果

    1 限制性内切酶HpaⅡ消化前，所有样本(包括急性白血病和正常对照)均能扩增出一条与预期长度相同的特异性DNA片段。经优化反应条件后，无非特异性扩增片段。10份正常对照标本经HpaⅡ酶切后，特异性PCR产物均消失，表明限制性内切酶消化完全，正常人p15基因CpG岛未发生甲基化。

    2 36例急性白血病HpaⅡ，酶切后PCR扩增结果 经HpaⅡ酶切后的36例急性白血病患者中，有22例仍能扩增出特异性PCR产物，另外14例特异性条带消失，p15基因外显子1 CpG岛甲基化的阳性率为61.1％，其中ANLL 65.4%(26例中17例），ALL 50.0%(10例中5例）。见图2。

    3 p15基因甲基化患者的临床特点 26例ANLL患者p15基因甲基化组与未甲基化组性别、年龄、外周血白细胞计数及骨髓原始+（早）幼细胞百分比结果见表1。

   1～4：ALL；5～9：ANLL；10：正常对照；M：PCR Marker,其中2，4，5，7，8，9为阳性结果

   2 HpaⅡ酶切后PCR反应结果

   讨 论

    恶性肿瘤细胞的本质特征之一是具有无限增殖的潜能，而细胞增殖须通过细胞有丝分裂周期即G1→S→G2→M来实现。细胞周期中G1→S的时相转变是关键步骤之一，主要由细胞周期素依赖激酶（CDK4，6）调控。p15基因编码产物p15蛋白通过与细胞周期素D1（cyclinD1）竞争性结合CDK4，6，抑制CDK4，6的活性，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞的增殖。p15基因及与其功能类似的p16基因常通过缺失而在包括白血病在内的多种人类恶性肿瘤中失活，最近的研究发现，位于p15及p16基因启动子及转录起始区的CpG岛高度甲基化是使该基因失活的另一方式，且在不同类型肿瘤间存在选择性，在实体瘤(如肺癌、结肠癌)中主要累及p16基因，在白血病中多累及p15基因。CpG岛是位于基因5′端富含CG碱基的DNA片段，长度一般为0.5～2.0kb ，在正常组织中处于非甲基化状态。甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ的识别序列是5′-CCGG-3′ ，当第2个C发生甲基化后将不能切开此序列，在我们所使用的二条引物之间的DNA上有5个HpaⅡ的酶切位点。所以根据酶切后DNA的PCR扩增产物的有无即可判断CpG岛的甲基化状态，且不受正常细胞污染的影响，关键是避免假阳性，即基因组DNA被消化完全。一般说来，10U HpaⅡ足以消化1μg DNA，10名正常对照的结果也已证实这一点，另外，对阳性标本加大内切酶量重复试验，结果与原来相同，表明酶切是完全的。

   表1 p15基因甲基化的ANLL患者的临床特点

    (×109/L) 骨髓原始+

    (早)幼细胞 男 女 甲基化组 17 10 7 38.29±11.86 18.72±10.67 0.77±0.18 未甲基化组 9 6 3 36.67±11.63 10.92±6.56 0.54±0.20 t或∑P（i）值 0．517 0．076 1．990 2．970 P值 ＞0．05 ＞0．05 ＜0．05 ＜0．01

    我们发现，p15基因在急性白血病中甲基化的阳性率为61.1%，Herman等［5］发现p15基因在急性白血病中总的甲基化率达75%，如果同时检测基因缺失情况，p15基因的失活率可能会更高。对26例ANLL患者临床资料的分析发现，有p15基因甲基化者比未甲基化者有较高的外周血白细胞计数和骨髓原始、（早）幼细胞百分比。可见p15基因甲基化在急性白血病中有较高的发生率，其功能失活可能是导致部分急性白血病发生及发展的原因之一。

    总之，p15基因甲基化在急性白血病中较为常见，DNA去甲基化剂也可以使发生甲基化的p15基因重新转录mRNA［3］，作为急性白血病潜在的治疗手段，p15基因甲基化值得深入研究。参考文献

    1，Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many types. Science, 1994, 264:436-440.

    2，Hebert J, Cayuela JM, Berkeley T, et al. Candidate tumor-suppressor genes MTS1 (P16INK4A) and MTS2 (P15INK4B) display frequent homozygous deletions in primary cells from T but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias. Blood,1994,84:4038-4044.

    3，Herman JG, Jen J, Merlo A, et al. Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor role for p15INK4B. Cancer Res, 1996, 56: 722-727.

    4，Jen J,Harper W, Bigner SH,et al. Deletion of p16 and p15 genes in brain tumors. Cancer Res, 1994,54: 6353-6358.

    5，Herman JG, Civin CI, Issa JPJ, et al. Distinct patterns of inactivation of p15INK4B and p16INK4A characterize the major types hematological malignancies. Cancer Res, 1997, 57: 837-841.

   (收稿日期：1999-07-05)