荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病异常染色体

   荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病异常染色体

   中华血液学杂志 1999年第12期第20卷 专 论

   作者：杨科 黄凌燕

   单位：100700 北京军区总医院血液科

    关键词： 原位杂交，荧光；染色体异常；白血病，淋巴细胞性，急性；DNA探针

    【摘要】 目的 研究荧光原位杂交技术(FISH)在检测异常染色体中的应用价值及其意义。方法 用 FISH方法和染色体G分带技术对比观察急性淋巴细胞白血病(ALL)患者染色体的变化。结果 对38例患者17,18和21号染色体进行G分带技术检查，结果分别有11,13和18例患者细胞染色体存在三倍体细胞。 FISH检查结果，除上述病例发现三倍体细胞外，染色体G分带检查正常者中也有部分病例存在三倍体。结论 FISH检测异常染色体，方法简便、灵敏、可靠，与常规细胞遗传学方法比较， FISH方法不需要培养细胞，对分裂期和分裂间期细胞均可进行基因定位检测，尤其在有核细胞少等不适于进行细胞遗传学分析的情况下， FISH方法仍可得到有意义的数据。

   Detection of aberrant chromosomes in acute lymphoblastic leukemia by fluorescence in situ hybridization

   YANG Ke,HUANG Lingyan.

    Beijing Army General Hospital of PLA,Beijing 100700

    【Abstract】 Objective To investigate the value of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting aberrant chromosomes in acute lymphoblastic leukemias. Methods Conventional banding techniques and FISH were used to detect trisomy 17,18 and 21 in 38 patients with acute lymphoblastic leukemia.Lymphoid DNA probes specific for chromosomes no.17,18 and 21 were used for FISH.Results Out of the 38 patients,18 had +17,22 +18 and 23 +21.The number of trisomy cells ranged from 7% to 80%. Ten normal bone marrow samples were hybridized with the chromosomes 17,18 and 21 probes.Conclusion FISH is more sensitive than conventional cytogenetic analysis and allows systematic study on large cohort of patients without the need of metaphase preparations.

    【Key words】 In situ hybridization,fluorescence Chromosomal abnormalities Leukemia,lymphoblastic,acute DNA probes

    染色体G分带技术为白血病的诊断和预后提供了重要的依据，在急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者中发生较多变化的染色体为17,18和21号染色体［1］。这些染色体数量或结构上的异常都能通过G分带技术及荧光原位杂交技术(FISH)进行检测，由于染色体G分带技术需要收集大量分裂期细胞，而且大部分ALL患者存在异常多倍体细胞及复杂的染色体核型，使得G分带技术具有很高的难度，而FISH采用特殊α卫星着丝粒探针，可以用来检测分裂间期异常染色体。在ALL患者中，FISH的应用，可以更容易检测到异常17,18和21号染色体。我们通过检查38例ALL患者的染色体，对FISH及染色体G分带技术进行了比较。

    病例和方法

    1 病例 1993年12月～1995年2月收集38例初治ALL患者标本，其中女性11例，男性27例，年龄2～59岁。10份正常标本来自非血液病患者(肺癌7例，食管癌3例)。骨髓单个核细胞用Ficoll方法进行分离，用0.075 mol/L KCl低渗液处理后，用甲醇∶冰醋酸(3∶1)反复抽提并固定，-20 ℃保存。

    2 细胞遗传学分析 骨髓及外周血经短期培养 (37 ℃24小时)后，终止于有丝分裂中期，应用G分带技术分析15～20个分裂中期细胞，核型分析根据染色体国际命名法(ISCN,1978)。

    3 免疫表型分析 单个核细胞用间接免疫荧光标记，用荧光显微镜观察。所用单克隆抗体包括 T、B淋巴细胞及髓系细胞表面相关抗原的抗体。

    4 FISH 将储存于-20 ℃的细胞分别滴于玻片上，并置玻片于55 ℃过夜，再用100 μg/ml RNase处理，37 ℃ 1小时，然后分别用体积分数为 70%、80%和100%的冷乙醇脱水，空气中干燥，再用体积分数为70%的甲酰胺70 ℃水浴中灭活2分钟，2× SSC洗3次，每次 4分钟，用冷乙醇脱水。杂交混合液包括15 μl DNA探针及30 μl杂交液。70 ℃水浴5分钟后，将杂交混合液加在玻片上，37 ℃湿盒中杂交过夜，杂交结束后分别用2×SSC、体积分数为50%的甲酰胺，2× SSC及 1×PBS冲洗，每次10分钟，再用荧光标记抗生物素蛋白及抗生物素蛋白抗体37 ℃作用30分钟，用PBS冲洗3次，最后分别用1 μg/ml碘化丙锭及二脒基苯基吲哚对染色体组及核酸染色。

    5 DNA探针 生物素标记的α-卫星中心着丝粒探针，用于观察17,18和21号染色体组(DNA探针系美国加利福尼亚大学周志远教授赠)。

    6 杂交结果观察 利用Olympus荧光显微镜读片，IB及U激发光，计数500个细胞。

    结 果

    1 临床资料分析 38例ALL患者骨髓原始和幼稚淋巴细胞占0.40～0.90，外周血白细胞计数为(2.5～32.9)×109/L，其中12例为 L1，21例为L2， 5例为L3。免疫分型：12例为 T细胞型， 8例为前 B细胞型，11例为普通型， 4例为 B细胞型， 3例为 T、B双表型。

    2 细胞遗传学分析 38例 ALL患者中32例存在染色体异常，6例正常。28例存在染色体结构异常，29例存在多倍体细胞(见表1)。

   表1 ALL患者17，18和21号染色体G分带检查与FISH检查结果比较

    百分率(%) +18细胞

    百分率(%) +21细胞

    百分率(%) 其它异常 +17细胞

    百分率(%) +18细胞

    百分率(%) +21细胞

    百分率(%) 1 48 0 84 +21,+X,del(6q) 30 0 70 2 56 0 80 +21,+10,+9,+22,t(1;14) 28 0 70 3 0 58 0 0 0 40 0 4 0 59 0 +10,+22,+X,+19,+20,+18 9 42 0 5 0 0 45 +4,+10,+9,+X,+12,t(9;22)(q34;q11) 0 0 40 6 40 0 60 +21,+X,+4,+10,+11,+12,+14,+20 48 11 68 7 0 57 95 +21,del;(2q),t(9;22)(q34;q11) 0 40 78 8 64 0 0 t(9;22)(q34;q11) 65 11 0 9 0 90 90 +21,t(8;14)(q21;11) 0 78 70 10 0 85 0 +21,+X,+9 0 60 9 11 0 0 0 0 8 9 7 12 0 0 0 0 0 0 11 13 0 0 0 0 0 0 11 14 0 60 70 +21,+10,del(2q) 0 37 78 15 0 0 0 0 7 0 0 16 0 0 0 0 0 0 0 17 73 95 0 +18,+20,del(11q) 70 80 0 18 0 0 34 +9,+22 0 0 38 19 0 0 45 +21 0 12 54 20 0 0 48 +21 0 10 40 21 90 90 0 +18,+X,+2,+15,+12 65 78 0 22 0 0 50 0 0 0 45 23 0 65 0 0 0 31 0 24 0 0 40 del(2q) 0 0 54 25 0 0 40 t(9;22)(q34;q11) 0 0 38 26 65 80 64 +18,+21,+9 45 68 21 27 0 0 0 +22,+X 11 10 0 28 0 0 38 t(9;22)(q34;q11) 0 0 45 29 0 0 0 t(9;22)(q34;q11) 9 12 0 30 0 78 0 +18 11 60 0 31 82 0 92 +10,+X,+21,t(9;22)(q34;q11) 65 0 68 32 0 0 0 0 0 0 8 33 0 0 42 +10,+X 0 0 45 34 0 0 51 +21,+10,+X 0 11 44 35 57 68 0 +18 40 38 0 36 62 0 0 0 44 0 0 37 0 0 0 +9,+X 0 10 0 38 60 60 0 +18,+22,t(9;22)(q34;q11) 40 32 0

    3 正常对照和ALL患者的7,18和21号染色体FISH检查结果 10例非血液病患者染色体核型检查均正常。17，18和21号染色体FISH检查结果，97.0%、98.0%及96.5%杂交信号数为2，而三倍体细胞百分率均数分别为2.5%、1.7%和2.8%。对于ALL患者，可将17，18，21号染色体三倍体信号数分别大于5.3%、4.1%和6.0%定为阳性 (即＞＋2s)。38例 ALL患者中37例存在三倍体细胞，仅1例为正常。4961

    4 染色体G分带与 FISH检查结果比较 (表1)

    4.1 17号染色体细胞遗传学及 FISH检查结果：常规细胞遗传学染色体G分带技术检查，38例中11例存在三倍体细胞，异常细胞数为 40%～90%。 FISH检查此异常17号染色体三倍体数细胞数为28%～70%，另外在染色体G分带检查正常者中检出6例存在三倍体，异常细胞数为7%～11%。

    4.2 18号染色体G分带技术和FISH检查结果比较：常规染色体G分带技术检查38例 ALL患者中13例存在三倍体，异常细胞数为57%～95%，FISH检查此13例异常细胞数为31%～80%。另外在染色体G分带检查结果正常者中发现9例存在三倍体，异常细胞数为9%～12%。

    4.3 21号染色体的G分带检查及FISH检查结果：38例患者进行染色体G分带技术检查，其中18例存在三倍体，异常细胞数为34％～95％。 FISH检查此18例也存在三倍体细胞，异常细胞数为21%～78%，另外20例染色体G分带检查阴性者，FISH检查发现其中5例存在三倍体，异常细胞数为7%～11%。

   讨 论

    通过对38例ALL患者进行染色体G分带技术及FISH检查，我们发现FISH技术由于在二维图像上杂交信号重叠、靶DNA未完全灭活、探针杂交不完全等原因，使得部分正常标本出现阳性结果，Baumann等及Lom等［2，3］利用不同探针也有不同的假阳性报道，因此FISH异常杂交信号阳性率大于多少才算有意义 如果标准过高，就会将微量残留病或早期复发检测为阴性；标准过低，又会出现假阳性。我们根据10例正常骨髓的检测结果，将＞+2s定为阳性。从实验结果可以看出，G分带技术对17,18及21号染色体三倍体检查结果与FISH结果相同，只是大部分异常细胞数百分率低于分带技术检测结果，文献也有类似报告，原因未明［4］。另外，部分17，18，21号染色体G分带技术检查正常，而FISH检查异常，这可能由于分带技术至多能分析20个左右的细胞分裂相，而FISH计数可以多达500个左右细胞，因而结果更直接、可靠，而且与常规细胞遗传学方法比较，FISH不需要培养细胞，对分裂期及分裂间期细胞均可进行基因定位检测，在化疗或骨髓移植后早期，有核细胞少，不适于进行细胞遗传学分析， FISH方法仍可得到有意义的数据。

    由于大部分 ALL患者均存在多倍体细胞，因此单纯依靠个别染色体探针不能完全指导临床或作为观察预后指标［5］。我们选用畸变率较高的17,18,21号染色体作为观察对象，通过FISH检查，发现17,18和21号染色体分别有45%,58%和61%为三倍体细胞，高于文献报告结果［6］，这可能由于样本量小，不能代表总体水平，也可能由于文献所采用常规细胞遗传学分析，许多阳性结果未被发现。

    参考文献

    1 Michael PM,Garson OM,Ekert H,et al.Prospective study of childhood acute lymphocytic leukemia:hematologic,immunologic and cytogenetic correlations.Med Pediatr Oncol,1988,16:153-161.

    2 Baumann H,Cherif D,Berger R.Interphase cytogenetics by fluorescent in situ hybridization for characterization of monosomy 7 associated myeloid disorders.Leukemia,1993,17:365-374.

    3 van Lom K,Hagemeijer A,Smit EME,et al.In situ hybridization on Giemsa-stained bone marrow and blood smears of patients with hematologic disorders allows detection of cell-lineage-specific cytogenetic abnormalities.Blood,1993,82:884-888.

    4 Martin B,Hartmut D,Georges C,et al.Fluorescence in situ hybridization in leukemias:"THE FISH are Spawning!".Leukemia,1994,8:1447-1452.

    5 Lorna M,Secker W.Prognostic and biological importance of chromosome findings in acute lymphoblastic leukemia.Cancer Genet Cytogenet,1990,49:1-13.

    6 Bertil J，Fredrik M,Felix M.Secondary chromosomal abnormalities acute leukemias.Leukemia,1994,8:953.

   收稿：1998-08-03 修回：1999-02-10