胃癌、大肠癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系

   胃癌、大肠癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系

   癌症 2000年第1期第19卷 基础研究

   作者：张雁 贾汝梅 张玉印 王凤安 宋伟庆 闫庆辉 庄甲举

   单位：张雁 贾汝梅 张玉印 王凤安 宋伟庆 闫庆辉（河北医科大学附属第二医院胃肠外科，河北石家庄050000）；庄甲举（解放军石家庄医学高等专科学校，河北石家庄050000）

   关键词：胃癌；大肠癌；端粒酶；聚合酶链反应；流式细胞术

    摘 要：目的：研究胃、大肠癌与端粒酶表达活性及DNA倍体的关系。方法：端粒重复扩增―酶联免疫吸附法（TRAP??ELISA法）检测肿瘤及无瘤残端粘膜端粒酶活性,流式细胞术检测肿瘤的DNA倍体。结果：肿瘤瘤体端粒酶阳性者占84.0％（42/50）,无瘤残端酶阳性者占2.0％（1/50）；端粒酶阳性肿瘤中异倍体肿瘤占52.38％（22/42）,而端粒酶阴性肿瘤无异倍体出现；端粒酶阳性瘤体平均直径6.5cm,阴性瘤体平均直径3.9cm;端粒酶阳性肿瘤淋巴转移率为59.5％（25/42）,阴性者转移率为12.5％（1/8），四者差别均有显著意义，P值分别为：P＜0.005,P＜0.05，P＜0.002,P＜0.05。结论：胃癌及大肠癌端粒酶活性升高,酶阳性肿瘤异倍体发生率高，且瘤体大，淋巴转移率高，说明端粒酶的激活在恶性肿瘤的发生发展中是重要因素，并且与疾病的进程相关。

    分类号：R735.2；R735.3 文献标识码：A

    文章编号：1000－467X(2000)01－0042－03

   Telomerase activity and DNA ploidy in gastric cancer

    and colorectal cancer

   ZHANG Yan, JIA Ru-mei, ZHANG Yu-yin, et al.

    (Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000， P.R.China )

    Abstract:Objectives：To study the relation between telomerase activity or DNA ploridy and progression of gastric cancer and colorectal cancer.Methods：Telomerase activity was detected using telomeric repeat amplification protocal-enzyme linked immunosorbent assay(TRAP-ELISA). The DNA content was detected using flow cytometry.Results：Most of the carcinomas (42/50) were telomerase positive, but the telomerase activity was observed infrequently in adjacent mucosa (1/50) (P＜0.005). In this study, the aneuploid carcinomas were 52.38％ (22/42) in telomerase-positive group, but there were no aneuploid carcinoma in telomerase-negative gronp, (P＜ 0.05). The mean diameter of telomerase-positive carcinomas was 6.5 cm, but the diameter of telomerase-negative carcinomas was 3.9 cm (P＜ 0.002). The percentage of lymph node metastasis in telomerase-positive carcinomas (25/42) was higher than that in telomerase-negative carcinomas (1/8), P＜ 0.05.Conclusions：Telomerase is important in the carcinogenesis of gastric cancer and colorectal cancer, and it is correlated with the progression of the diseases.

    Key words： Gastric cancer; Colorectal cancer; Telomerase; Polymerase chain reaction; Flow cytometry ▲

    近年来对恶性肿瘤发病机制的研究越来越深入，其与染色体的畸变、原癌基因的激活、抑癌基因的突变等有密切联系。我们研究发现胃癌、大肠癌的发生与端粒酶激活关系密切，提示端粒酶在消化道肿瘤的发生、发展中起重要作用。

    1材料与方法

    1.1材料

    本实验共取标本50例，为1998年2月～1998年9月就诊于河北医大附属二院的病人，其中胃癌30例，年龄40～71岁，男∶女为22∶8。大肠癌20例，年龄24～70岁。男∶女为12∶8。所有病例均经病理证实为癌，接受手术治疗。手术切除标本后立即取材，投入冰盒。用于端粒酶检测的标本半小时内置于－80℃冰箱保存；用于DNA倍体分析的标本用70％酒精固定，4℃冰箱保存。所取标本均在一个月内检测。用于端粒酶检测的试剂为德国宝灵曼公司Telomerase PCRELISA试剂盒提供，PCR循环仪为美国PE公司产品，型号480。流式细胞仪为B.D公司FACSCalibur。

    1.2方法

    1.2.1端粒酶检测：采用TRAP－ELISA方法，具体步骤如下：取2mm3标本加裂解液60μl，剪碎，0℃静置30分钟后于15000prm4℃离心20分钟，取上清液5μl（紫外分光光度法测定蛋白含量约50μg），PCR循环混合物25μl（扩增引物为biotin标记）蒸馏水20μl进行PCR扩增：循环1∶10min，25℃；循环2：5min，94℃；循环3～32：30s94℃，30s50℃，90s72℃；循环33：10min，72℃。PCR循环产物5μl，变性液20μl混匀，常温放置10min，加杂交液225μl（杂交探针为DIG标记）。取混合物100μl加入MTP板（已包被biotin抗体）常温静置2小时。洗板后，加入抗DIG-POD抗体室温静置30分钟，洗板，再加入POD底物100μl，反应15分钟加终止液，于30分钟内用酶标仪读取吸光度值（OD）。（450nm为检测波长，960nm为参考波长）。当OD≤0.200为阴性，0.200＜OD≤0.500为＋，0.500＜OD≤1.000为＋＋，OD＞1.000为＋＋＋。

    1.2.2DNA倍体检测：将5mm3标本在120目钢网上网搓研磨成细胞悬液，100转/分常温离心5分钟弃上清液，加入0.5％胃蛋白酶2ml37℃消化30分钟，300目尼龙网过滤，1000转/分离心5分钟后弃上清，加入70％酒精3ml于4℃冰箱过夜。采用Bio-Rad公司提供的DNA INDEX AND CELL CYCLE EVALUATION试剂盒，用一步法进行DNA倍体的检测，DNA指数（DI）在0.9～1.1者为二倍体，不在此范围者为异倍体。

    1.2.3统计学处理：分别采用χ2检验，t检验和秩和检验，具体统计学方法见文中诸表。

    2结果

    胃癌及大肠癌均为恶性肿瘤，有无限增殖的特性,经检测瘤体的端粒酶阳性率为84.0％，＋＋＋者为13例，＋＋者为10例，＋者为19例，无瘤残端阳性率为2.0％，且为弱阳性，瘤体及残端的阳性率有显著差异，P＜0.005（见表1）。说明端粒酶激活在消化道肿瘤中是一种普遍现象。

   表1 瘤体及无瘤残端端粒酶活性比较

    统计学处理：采用校正χ2检验P＜0.05 端粒酶活性及肿瘤临床特征的关系见表2，酶活性与病人的年龄、性别及肿瘤的大体分型和病理分型无关，而瘤体大小、淋巴转移影响着酶活性。端粒酶阳性的肿瘤平均直径为6.5cm，较酶阴性的肿瘤平均直径3.9cm为大（P＜0.002），端粒酶阳性肿瘤淋巴转移率为59.5％，明显高于端粒酶阴性（12.5％）的肿瘤（P＜0.05）。

   表2 端粒酶活性与肿瘤临床特征的关系

    统计学处理：1、3项采用t检验分析；2、4项采用校正χ25819

    检验；5、6采用秩和检验的正态近似法 同时我们用流式细胞术测定了标本的DNA含量（见表3），端粒酶阳性肿瘤异倍体占52.38％，阴性者均为二倍体，端粒酶阳性肿瘤异倍体比例明显升高（P＜0.05)，流式细胞术测定DNA标本倍体，结果见图1～5。

   表3 端粒酶活性与细胞DNA倍体关系

    统计学处理：采用χ2检验P＜0.005

   图1正常人血DNA倍体图

    DI=1.00；S=0.00％；CV=1.44

   图2胃癌标本DNA倍体图（二倍体）

    DI=1.07；S=25.85％；CV=4.57

   图3结肠癌标本DNA倍体图（二倍体）

    DI=1.08；S=18.13％；CV=4.03

   图4胃癌标本DNA倍体图（异倍体）

    整倍体峰：DI=0.98；S=0.00％；CV=11.74

    异倍体峰：DI=1.38；S=37.68％；CV=7.62

   图5直肠癌标本DNA倍体图（异倍体）

    整倍体峰∶DI=1.03；S=0.00％；CV=7.42

    异倍体峰1∶DI=1.24；S=43.58％；CV=4.13

    异倍体峰2∶DI=1.50；S=0.00％；CV=8.31

    3讨论

    端粒是染色体末端的一段特殊序列，由DNA及蛋白质组成［1］。端粒的存在使染色体末端保持稳定。由于DNA聚合酶不能复制端粒，所以其随细胞分裂而缩短，当缩短到一定程度后细胞将死亡。细胞中存在一种特殊的酶――端粒酶能延长端粒［2］，使细胞成为永生化细胞。正常体细胞中端粒酶无活性，随着有丝分裂次数的增加，端粒逐渐缩短，细胞先后经历M1期、M2期后由于端粒极度缩短，染色体出现各种异常形态，绝大部分细胞将死亡，极少数细胞激活了端粒酶，端粒不再缩短，成为永生化细胞，这就是肿瘤发生的“端粒?捕肆Ｃ秆?说”［3］。Monika等［4］检测了正常结肠粘膜50例、结肠炎10例、结肠腺瘤20例、结肠癌50例，端粒酶阳性率分别为0％、40％、60％、90％。Hiyama等［5］检测66例胃癌及残端端粒酶活性，早期胃癌的阳性率为82％(14/17)，中晚期阳性率为86％(42/49)，残端阳性率为6％(4/66)，且端粒酶阳性的肿瘤瘤体大、淋巴转移率高、预后差。本实验中胃癌端粒酶阳性率为83.3％，大肠癌为85％，非瘤残端阳性率为2.0％。同时我们的检测也表明：端粒酶活性与病人年龄、性别、肿瘤的大体及病理分型无关，而与瘤体的大小及淋巴转移率有明显关系，与上述文献报道相符。以上这些研究结果显示：端粒酶活性升高在胃癌和大肠癌中是一种普遍现象，并且可以在癌前病变组织中检测到。随着病变的进展其阳性率升高，与疾病进程相关。端粒酶阳性者肿瘤淋巴转移率升高，与恶性肿瘤生物学行为有密切联系。端粒酶可以作为胃肠道肿瘤诊断的有力标志物。

    检测中我们发现一例胃癌残端为端粒酶阳性，病理检测为粘膜重度炎症伴不典型增生。该例残端酶阳性的原因为：（1）残端组织重度炎症，大量淋巴细胞浸润，而淋巴细胞有微弱的端粒酶活性［6］，所以炎症反应极重的组织可能端粒酶会呈弱阳性；（2）残端组织含微转移灶所致：病理往往仅能通过光镜检测一个平面有无癌转移，端粒酶检测则是测定立体团块细胞的酶活性，比光镜更全面，更易发现肿瘤微转移灶；（3）癌前病变也可导致端粒酶阳性表达［7］。该残端阳性的病例为重度肠上皮化生，可导致端粒酶阳性表达。

    在端粒酶激活过程中，端粒将缩短，端粒的主要功能之一是维持染色体的稳定性，防止染色体相互融合及降解。当端粒缩短到一定程度而不能维持其功能，染色体就会发生畸变，形成双着丝粒染色体、环行染色体及染色体缺失等［8］，此时细胞便表现为异倍体。同时这些极短的端粒也会激活端粒酶，所以端粒酶阳性的细胞异倍体比例较高。本实验中酶阳性者异倍体占52.4％，而阴性者无异倍体出现。日本学者Okusa等［9］的研究结果与我们相似，认为异倍体肿瘤的端粒酶活性高于整倍体肿瘤。异倍体肿瘤染色体发生畸变，恶性程度高，转移率高，预后差。因而，端粒酶活性可以反应肿瘤的恶性潜能，与病人预后相关。

    总之，胃癌及大肠癌端粒酶活性升高，端粒酶阳性肿瘤较阴性者瘤体大、淋巴转移率高、异倍体含量高、预后差。所有这些结果均表明：端粒酶激活在恶性肿瘤进程中是重要因素，端粒酶检测可为临床肿瘤预后判断提供有用信息。

    基金项目：本课题受河北省卫生厅基金(98002号)资助

    ＊通讯作者：Tel：86－311－7046901－6831

    E??mail：meaky??zdgm@163.net

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    [7]Yashima K, Litzky LA, Kaiser L, et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinoma [J]. Cancer Res, 1997,57： 2373.

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   收稿日期：1999－03－16

   修回日期：1999－04－23