流感嗜血杆菌血清分型及其产酶率的初步研究

   流感嗜血杆菌血清分型及其产酶率的初步研究

   中华结核和呼吸感染 1999年第12期第22卷 论著

   作者：王桂芳 罗文侗 修清玉 方正 赖国祥 颜泽敏

   单位：200003 上海，第二军医大学长征医院呼吸科

    关键词： 流感嗜血杆菌；感染率；携带率；血清分型；β内酰胺酶

    【摘要】 目的 了解上海地区流感嗜血杆菌(Hi)感染株、携带株的血清型及主要血清型的β内酰胺酶产生率。方法 收集急性上、下呼吸道感染患者的痰及咽拭子等标本534份及无呼吸道感染对照组咽拭子标本255份，应用改良哥伦比亚巧克力培养基进行分离培养；应用玻片凝集法及反向间接血凝法对分离出的Hi进行血清分型，并检测Hib 和不可分型株（NTHi）产β内酰胺酶情况。结果患者组标本中共分离出Hi 164株，分离率为31%(164/534)。其中Hib 69株，占42%(69/164)，NTHi 91株，占56%(91/164)。对照组共检出Hi 66株，检出率为26%(66/255)，其中Hib 为14株，占21%(14/66)，NTHi 49株，占74%(49/66)。患者组160株Hib和NTHi共产β内酰胺酶38株，二者共同阳性36株，Hi产酶率23%（36/160）；Hib产酶阳性率为29%（20/69），NTHi产酶阳性率为20%（18/91）。有16株对氨苄西林耐药的菌株不产β内酰胺酶。结论 Hi的血清型在患者组和对照组均以Hib和NTHi为主，Hib分离率患者组高于对照组。Hib产酶率高于NTHi。

   Study on serotyping of Haemophilus influenzae and the positive rates of β-lactamase

   WANG Guifang,LUO Wentong,XIU Qingyu,et al.

    Department of Respiratory Diseases Changzheng Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200433

    【Abstract】 Objective To investigate the serotypes of both infectious and carriage strains of Haemophilus influenzae （Hi）and to evaluate the prevalence of β-lactamase of major serotypes in Shanghai. Methods The 534 specimens of sputum and swabs from patients with acute upper or lower respiratory tract infection and 255 cases of control group were collected and incubated on improved Collumbia chocolate medium. All isolated Haemophilus influenzae strains were serotyped by slide agglutinating assay or reverse indirect blood agglutinating method. β-lactamase were measured by iodine test and paper disc method. Results In the patient group, of the 164 Hi strains there were 69 Hib strains (42%，69/164) and 91 NTHi(56%，91/164).In the control group,there were 14 strains of Hib and 49 strains of NTHi among 66 strains of Hi,which were isolated from 255 specimens(26%，66/255). 24%(38/160) of Hi in the patient group produced β-lactamase .In this group,the positive rate of β-lactamase was 29%(20/69) for Hib strains and 20%(18/91) for NTHi strains.Sixteen strains resisting to ampicillin were β-lactamase negative. Conclusions These results indicate that Hib and NTHi are the major serotypes of Hi in both the patient and control group.The prevalence of Hib is higher in patients than in the control.Hib strains are more likely to produce β-lactamase than NTHi.

    【Key words】 Haemophilus influenzae Infection rate Carriage rate Serotype β-lactamase

    流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae, Hi）是呼吸道感染的常见致病菌，尤其是社区获得性肺炎的重要致病菌之一。国外多年来已开展了对Hi的血清分型工作，并对感染与血清型之间的关系进行了大量防治研究工作。近几年来，我们在制备了Hi培养基和提高分离率的基础上，开展了Hi的血清分型研究，并对型别分布、主要血清型产β内酰胺酶情况进行了初步研究，以期为防治Hi感染提供理论基础和临床指导。现将结果报告如下。

    材料与方法

    一、材料

    1．标本来源：选择我院呼吸科及儿科门急诊、部分住院患者共789人次。其中患者标本534份，包括痰标本218份，咽拭子标本289份，鼻窦穿刺物及分泌物15份，中耳分泌物5份，切除扁桃腺标本7份；对照组255份，为儿科门诊包茎及小儿多动症患者，2周内无呼吸道感染症状，无抗生素应用史，包括痰标本16份，咽拭子239份。

    2．培养基：按分离培养及鉴定需要［1］分别配制以下培养基：改良哥伦比亚巧克力培养基、普通豆粉血琼脂培养基、营养琼脂培养基。

    3．质控菌株：流感嗜血杆菌ATCC 49247。

    4．氨苄西林纸片（AM,10 μg）及β内酰胺酶纸片均为上海市卫生防疫站提供，青霉素溶液、碘溶液、淀粉溶液等按陆永绥等［2］方法进行配制。

    二、方法

    1．细菌鉴定及保存：所有标本均于取材后2小时内接种于普通豆粉血琼脂培养基及改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基各1份，37℃，5% CO2，18～24小时孵育。挑取哥伦比亚巧克力培养基上半透明直径1～3mm菌落，Hi鉴定依据为：培养基上呈圆形隆起的无色透明或灰白色菌落，湿润，有特殊闪光；革兰染色阴性的多形球杆菌；血琼脂平皿上不溶血；生长需要Ⅴ、Ⅹ因子(分别以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和血红素代替)，卫星试验阳性。

    2．血清分型：（1）用Hib抗血清（首都儿科研究所）以玻片凝集法将所有菌株分为Hib和非Hib菌株。试验按玻片凝集法常规操作进行。（2）反向间接血凝法：按Hi血清分型反向间接血凝试剂盒（卫生部生物制品研究所）中的操作说明先验证健康人O型红细胞吸附抗体的活性。经过验证各型吸附抗体及多价抗体的活性正常后，先用多价抗体进行筛选，与多价抗体不凝集者为不可分型Hi（NTHi），然后用f、e、d、a、c型抗体对非Hib的Hi进行检测，与相应抗体致敏的红细胞发生凝集者，即判断为相应的血清型。

    3．β内酰胺酶（β-lac）检测：（1）碘测定法：按陆永绥等［2］的方法进行检测。（2）β内酰胺酶纸片法：在β内酰胺酶纸片上加1滴生理盐水，用无菌接种环挑取一个菌落涂于纸片上，10分钟内变红，表示检测菌产生β内酰胺酶菌。以上两种检测方法互相对照，并设阳性及阴性对照株。

    4．测定Hib和NTHi对氨苄西林耐药率的方法：用琼脂扩散法按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）规则操作，测定Hib和NTHi对AM的耐药率。详细操作方法见［3，4］。以流感嗜血杆菌ATCC49247作为质控株。

    三、统计学处理

    采用χ2判断结果差异的显著性。

    结果

    一、Hi分离率及血清分型

    在被分离出的230株Hi中，有90株可被分型，可分型率为39%（90/230）。其中患者组73株，对照组17株。可分型株分布在b、d、f三个型别中(表1)。从表1中可以看出,患者组的Hi分离率与对照组比较,差异无显著性(P＞0.05)。按血清分型计，两组均以NTHi为最多；在可分型菌株中，以Hib 为最多；Hid和Hif仅占少数，而Hic、Hie、Hia均未见。从两组的Hib分离率比较，患者组显著多于对照组(P＜0.05)。

    二、年龄与Hi和Hib分离率的关系

    在18岁以前，两组Hi及Hib均有年龄越小，分离率越高的趋势。70岁以上患者，Hi及Hib的分离率较70岁以下的成年人高，而与7～12岁年龄组相仿（表2）。

   表1 两组临床标本Hi分离率及血清分型分布情况

   534

   164

   31

   69

   42

   3

   1.8

   1

   0.6

   91

   56 对照组 255 66 26 14 21 1 1.5 2 3.0 49 74 合计 789 230 29 83 11 4 0.51 3 0.34 140 18

   表2 年龄与Hi和Hib分离率的关系6937

    （岁） 标本数 患者组 对照组 Hi Hib 标本数 Hi Hib 株数 率（%） 株数 率（%） 株数 率（%） 株数 率（%） ＜2

   31

   18

   58

   12

   39

   15

   6

   40

   1

   7 3～ 6 58 24 41 10 17 81 29 36 7 9 7～12 175 65 37 32 18 122 26 21 5 4 13～18 62 11 18 4 7 37 5 14 1 3 19～70 176 37 21 7 4 ＞70 32 9 28 4 13 合计 534 164 31 69 13 255 66 26 14 6

    三、Hi及Hib的分离率与标本来源的关系

    痰标本共218份，分离出Hi 45株，分离率为21%（45/218），其中Hib 14株，分离率为6.4%（14/218）；咽拭子标本共289份，分离出Hi 108株，分离率为37%（108/289），其中Hib 53株，分离率为18%（53/289）。Hi及Hib的分离率咽拭子标本均显著高于痰标本，经χ2检验，P＜0.05。另外，鼻窦穿刺物和切除扁桃腺Hi的分离率也高，各为40%（6/15）及57%（4/7）。

    四、分离菌株产β内酰胺酶情况

    对患者组160株Hib 和NTHi应用碘测定法和β内酰胺酶纸片法测定产β内酰胺酶情况，阳性共38株，二者共同阳性36株，阳性率为23%（36/160）。Hib中产酶者20株，阳性率为29%（20/69）；NTHi中产酶者18株，阳性率为19.8%（18/91）。

    五、Hi及Hib对氨苄西林的敏感性

    应用琼脂扩散法进行检测，发现上述160株中有52株对氨苄青霉素耐药，耐药率为33%（52/160）；其中36株为β内酰胺酶阳性菌株，16株为内酰胺酶阴性菌株，后者占Hi总株数的10%（16/160）；Hib 2株，占1.3%(2/160),NTHi 14株,占9%(14/160)。

    讨论

    本组结果提示，患者组的Hi检出率为31%，且年龄越小，其Hi的分离率越高，＜2岁者最高，检出率达58%。70岁以上的老年人其检出率也达到28%。在无呼吸道感染的对照组，咽拭子的Hi检出率较高为26%。与患者组的Hi检出率比较差异无显著性。说明年龄因素对Hi的感染率和携带率有较大影响。Geme利用扫描电镜和组织培养发现，NTHi可通过纤毛和非纤毛粘附素粘附和侵入到呼吸道上皮细胞，而侵入之后又通过外膜蛋白的改变来逃脱中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬，从而得以长期寄殖［2］。这也可（或）说明在儿童携带Hi较高，且主要携带NTHi的原因。

    良好的分型是进行Hi致病性及流行病学研究的基础。Hi分型通常有以下几种方法：血清分型［5］，多位点酶电泳分型［6］，外膜蛋白分型［7］，其中以血清分型临床应用最广泛，且操作简便。Hi 可根据荚膜的有无可分为有荚膜型和无荚膜型，前者根据荚膜多糖抗原性的不同又可分为a、b、c、d、e、f六个血清型。荚膜多糖具有型特异性，用型特异性抗血清进行玻片凝集法或荚膜肿胀试验可进行血清分型，以玻片凝集法常用。反向间接血凝法是根据抗原抗体特异性结合反应而设计的，灵敏度及特异性均高，快速、简单、经济实用等优点。我们根据国外研究经验，结合初步试验结果，将两种方法结合应用，可大大节约时间与试剂。方法为：先将所有菌株以玻片凝集法分为Hib和非Hib菌株，然后用多价抗血清进行筛选，分出NTHi，进一步用特异性抗体从非Hib菌株分出各血清型。国外学者对这些血清型与致病性及流行病学之间的关系进行了深入的研究，一致认为b型致病性最强，可引起以菌血症、脑膜炎等多种侵入性感染,主要发病年龄在学龄前儿童［8］。NTHi主要为健康人鼻咽部的寄殖菌，在学龄前儿童的携带率可达30%～40%［9］，甚至更高。

    有资料表明，Hi的感染或携带株均以Hib 和NTHi为主，其它型别仅占5%左右［10］。我们采用玻片凝集法和反向间接血凝法对患者组的Hi进行血清分型结果Hib和NTHi分别为42%和56%；对照组分别为21%和74%。同时我们发现年龄越小，Hib的分离率也越高，其中以＜2岁年龄组分离率最高，而70岁以上的老年人，Hib的分离率也高于青年人。提示在我国Hi的感染也以Hib和NTHi为主，且以小儿和老年人为主，与国外报道类似。我们的结果还显示，在儿童感染组中分离菌主要为Hib，而在成年人慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性发作期的患者中分离的Hi，主要为NTHi，无1株为Hib，在儿童携带者中也无1株为Hib。其他学者也有类似报道［11］。

    国外报道Hi产生β内酰胺酶的阳性菌株在5%～55%之间［12］。报道Hib和NTHi 产酶率分别为21%～32%和12%～16%之间［13］。本组160株Hib和NTHi产β内酰胺酶为38株，二者共同阳性为36株，阳性率为24%，Hib产酶率高于NTHi，分别为28%和18%，包括Hi产β内酰胺酶的阳性菌株和Hib及NTHi的产酶率均与国外报道类似。但Hib产酶率与NTHi产酶率作比较，二者差异无显著性（P＞0.05）。我们还观察到有2株Hib和14株NTHi为氨苄西林耐药菌株，但用两种β内酰胺酶检测方法均呈阴性结果。在总数中占10%的这一群体，国外学者称之为耐氨苄西林的β内酰胺酶阴性株（ARNβLs）［14］。其耐药机制可能是细胞膜通透性降低和青霉素结合蛋白的结构位点发生改变。

    我们的初步研究表明，Hib和NTHi为我院门、急诊及住院患者呼吸道感染的最常见菌型；儿童携带的Hi主要为NTHi。Hib产β内酰胺酶阳性率较NTHi高。上述结果可能有助于对Hi感染的防治。

    参考文献

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    10 Hugosson S, Silferadal SA, Garpenholt O, et al. Invasive haemophilus influenzae diseases:epidemiology and clinical spectrum before large scale H.influenzae type b vaccination. Scand J Infect Dis，1995，27:63-67.

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    14 Howard AJ,Williams HM.The prevalence of antibiotic resistance in haemophilus influenzae in wales. J Antimicrob Chemother， 1988，21:251-260.

   收稿:1999-08-02 修回:1999-11-04