1998～1999年北京地区流感病毒监测及血凝素基因分析

   1998～1999年北京地区流感病毒监测及血凝素基因分析

   中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 病毒学

   作者：贺雄 刘海林 刘成贵 朱汝南 万里涛 王芳 刘哲伟 钱渊 车莉 王之梁 朱宗涵

   单位：贺雄 刘海林（北京市卫生防疫站）；刘成贵 朱汝南 万里涛 王芳 刘哲伟 钱渊 车莉 王之梁 朱宗涵（100020 首都儿科研究所 北京感染与免疫中心实验室）

   关键词：流感病毒；血凝素；核苷酸序列

    【 摘要 】 目的 监测北京地区流感病毒流行，探讨其流行规律及血凝素抗原基因变异特征。方法 在1998年冬北京地区流感病毒暴发流行期间，于首都儿科研究所附属医院门诊及北京市防疫站采集标本进行病毒分离、鉴定，并对其中3株病毒的血凝素重链区（HA1）进行了核苷酸和氨基酸序列分析。 结果 共分离到流感病毒88株，经血清学鉴定为甲3型。与参考株A/Nanchang/933/95的核苷酸同源性为(97.0～97.7)%,氨基酸同源性为(94.2～95.4)%；与参考株A/Sydney/05/97 的核苷酸同源性为(98.0～98.9)%，氨基酸同源性为(96.4～97.6)%。 结论 本次北京地区流行的流感病毒为甲3型。与近年国内甲3流行参考株A/Nanchang/933/95相比，其HA1区发生了较大变异，而与国际上新出现的A/Sydney/05/97株相近，提示本次流行的毒株可能与国外有共同的起源。这是国内首次报道此次流行变异株的核苷酸序列。

   Surveillance and gene analysis of hemagglutinin of influenza virus during the outbreak of 1998-1999 in Beijing area

   LIU Chenggui, ZHU Ru′nan, WAN Litao

    （Beijing Municipal Laboratory of Infection and Immunity, Beijing 100020, P.R.China）

    【 Abstract 】 Objective Aetiological and molecular epidemiological surveillance of the influenza virus in Beijing area. Methods During the influenza outbreak in Beijing area of 1998-1999, specimens were collected from the Capital Institute of Pediatrics and the Beijing Epidemic Prevention Station. The isolates were identified by using McAb and the HA1 region of 3 isolates were sequenced. Results Eighty eight strains of influenza virus were isolated and identified as subtype A3. The analysis of the nucleotides and deduced amino acids suggested that the prevalence strains had experienced some variations as compared with the national reference strain A/Nanchang/933/95 of recent years, and showed high similarity with the new international prevalence strain A/Sydney/05/97. Conclusions The prevalence strains of the influenza outbreak of 1998-1999 in Beijing area were subtype A3 and there is certain antigenic drift in influenza virus in Beijing area. The results suggest that they may be Sydney-like strains and has the same origin with that new international prevalence strain.

    【 Subject words 】 Influenza virus; Hemagglutinin; Nucleotide sequence

    流感病毒不仅是引起急性呼吸道感染（ARI）的重要病原，而且是导致婴幼儿和老年人、尤其是患有慢性疾病老年人死亡的重要原因。由于该病毒抗原易变异而引起的暴发流行能在短期内导致大规模的人群发病，甚至引起世界范围内的流行。因此，能及时发现有意义的流感病毒新变种，特别是大流行株，将具有重大意义。为此，在流感监测的基础上，我们对流行期间分离出的3株流感病毒的血凝素重链区（HA1）进行了核苷酸和氨基酸序列分析。现将结果报道如下：

    材料和方法

    标本及测序毒株来源：从1998年12月7日至12月30日从首都儿科研究所附属医院门诊、急诊共收集急性上呼吸道感染咽拭子标本260例，其中男123例、女137例，最小1个月，最大14岁。从流行期间分离株选择3株病毒，其中2株（Bj330及Bj339）为本所分离株，1株（Jingfang235）由北京市防疫站提供。

    鉴定血清及试剂盒：美国疾病防治中心（CDC）提供。

    引物：用于cDNA合成和PCR扩增的引物有：H3F7（5′d-ACTATCATTGCTTTG）和H3R1073 (5′d-CCTGCGATTGCGCCGAAT)；用于序列测定的引物有：H3F7, H3R1073, H3R570（5′d-TGGCATAGTCACGTTCAG）和H3R792（5′d-CAGTATGTCTCCCGGTTT），均由CDC提供。

    病毒分离与鉴定：采用MDCK细胞接种分离〔1〕，根据细胞病变和微量血凝及血凝抑制试验来判断有否病毒存在。对分离阳性株采用甲1、甲3和乙型单克隆抗体进行鉴定〔2〕。

    逆转录-PCR反应：见文献〔2，3〕。

    核苷酸序列测定：机测，使用PE TECHNE公司的ABI373A型DNA测序仪。

    同源性分析：使用Blast2.0在GeneBank中进行核苷酸及推导的氨基酸序列比较，并使用了日立公司的软件DNASIS和PROSIS。本文仅列出了与参考株的详细比较结果。参考株A/Nanchang/933/95、A/Sydney/05/97的核苷酸与推导的氨基酸序列分别来自Genebank和CDC。

    结果

    1.病毒分离及鉴定：于流行期间从首都儿科研究所附属医院门诊、急诊共收集咽拭子标本260份，从中分离到流感病毒88株，阳性率为33.85%。其中50株使用单克隆抗体，经微量血凝试验及血凝抑制试验，鉴定结果证实为甲3型。

    2.血凝素重链区(HA1)基因核苷酸和推导的氨基酸序列分析： 表1结果显示，本次流行分离株（A/Beijing/339/98, A/Beijing/330/98, A/Jingfang/235/98）与参考株A/Nanchang/933/95的核苷酸同源性为(97.0～97.7)%，氨基酸同源性为(94.2～95.4)%；而与CDC提供的参考株A/Sydney/05/97的核苷酸同源性为(98.0～98.9)%，氨基酸同源性为(96.4～97.6)%。在GeneBank中进行同源性分析时，与某些国外A/Sydney/05/97-like分离株的核苷酸与推导的氨基酸同源性均可高达99%。5030

    图1和图2结果表明，3株1998年度分离株病毒的HA1区基因核苷酸长度均为987，编码329个氨基酸。与A/Nanchang/933/95相比，3株分离株共有21个氨基酸位点发生变异，其中有8个位点分别位于抗原决定簇A（133～137和140～146位氨基酸）和B（156～160和187～198位氨基酸）区；与A/Sydney/05/97株相比，共有14个氨基酸位点改变，其中有3个位点分别位于血凝素重链区抗原决定簇A区和B区。

    从图2还可看出，3株1998年度分离株病毒的HA1区所有半胱氨酸位点均未发生变异，表明它们之间的二硫键位置相同；此外，与参考株A/Sydney/05/97及A/Nanchang/933/95相比，分离株在122位多了一个糖基化位点。另外，第226位氨基酸均由I（异亮氨酸）变为V（缬氨酸），并非以前流感分离株HA1蛋白分子上第226位的L（亮氨酸）或Q（谷氨酰胺）。

   表1 1998-1999年度流感病毒分离株血凝素HA1基因核苷酸和氨基酸的同源性（%）

    Table 1. Identity(%) of nucleotides and amino acids of HA1 region of influenza virus isolats from 1998-1999

    SYD597=A/Sydney/05/97,BJ339=A/Beijing/339/98,BJ330=A/Beijing/330/98, f235=A/Jingfang/235/98, Nan933=A/Nanchang/933/95

    图2 1998-1999年北京地区流感病毒分离株血凝素重链区（HA1）推导的氨基酸序列比较

    Fig 2. Comparison of amino acids of HA1 region of influenza virus isolates in Beijing area from 1998-1999

    讨论

    流感病毒属正粘病毒属，为单股负链、分节段的RNA病毒，分甲、乙、丙3个型。基因共分为8个节段（丙型为7个），编码10个蛋白（丙型为9个），其中血凝素和神经氨酸酶为膜表面糖蛋白，是主要的表面抗原，也是导致病毒发生变异的最重要的抗原〔4〕。流感病毒流行至今仍未得到很好的控制，主要原因在于其血凝素（HA）基因具有高度变异性，其流行规律不易掌握。

    图1 1998-1999年北京地区流感病毒分离株血凝素重链区（HA1）核苷酸序列比较

    Fig 1. Comparison of nucleotides of HA1 region of influenza virus isolates in Beijing area from 1998-1999

    流感病毒的HA蛋白具有识别靶细胞表面受体并与之结合的功能，可与宿主细胞膜融合，并能诱导保护性中和抗体的产生。目前已知H3亚型流感病毒毒粒的HA蛋白分子上至少有5个抗原决定簇（A,B,C,D和E），并且都位于HA蛋白分子的重链区(HA1)，其中A和B区最为重要〔4〕。因此，HA1的氨基酸序列的改变常与流感病毒血凝素抗原性变异密切相关，有时也会造成病毒宿主范围的改变。因此，我们对1998～1999年度北京地区流行的流感病毒血凝素的HA1区的核苷酸和氨基酸序列进行了分析，并与以往的国内及国际的流行参考株进行了比较。

    从本次流行分离株的HA1区的核苷酸和推导的氨基酸序列同源性比较显示，与近年国内流行甲3型参考株A/Nanchang/933/95有较大差异，而更接近于国际上新出现的A/Sydney/05/97株。实验证明，本次流行分离株对以前使用的甲3型抗血清敏感性较差，而对悉尼株抗血清有很高的亲和性，其血凝抑制滴度可达1∶1280。不过要严格确定其是否为悉尼株还需要很多其它的抗血清，我们将继续进行鉴定。从WHO提供的有关资料来看，悉尼株已迅速成为当前全球流感病毒的主要流行株。结果提示，本次流行的毒株可能与国外有共同的起源。

    从推导的氨基酸序列分析，其变异主要集中在抗原决定簇最重要的A、B区；在第122位氨基酸位点上出现了一个新的糖基化位点，可能会导致血凝素抗原性的改变。这些变异导致了其抗原性发生了较大改变，引起了近些年来北京地区较大规模的一次流行。另外，据报道第226位氨基酸的变异可能与病毒的宿主范围有关〔5，6〕，本次流行株该位点均由I（异亮氨酸）变为V（缬氨酸），其意义有待探讨。

    另外，在本次流行分离株中选取了3株进行测序和分析，结果发现它们的核苷酸序列和推导的氨基酸序列之间都不尽相同，存在不太大的差异。可能的原因是，流感病毒具有很高的抗原漂移性，甚至在同一次流行中都会存在一定的差异。

   参考文献

    1，黄祯祥，洪涛，刘崇柏, 等. 医学病毒学基础及实验技术. 北京：科学出版社，1990.

    2，朱汝南, 耿学辉, 王之梁, 等. 应用逆转录-聚合酶链反应鉴别呼吸道合胞病毒亚型. 中华儿科杂志, 1998, 36(9):538-540.

    3，Pisareva M, Bechtereva T, Plyusnin A, et al. PCR-amplification of influenza A virus specific sequences. Arch Virol, 1992, 125:313-318.

    4，Murphy BR, Webster RG.Orthomyxoviruses: The Viruses and Their Replication. In: B.N. Fields and D.M. Knipe(ed.), Virology, 3rd ed. New York:lippincottraven Publishers, Philadelphia, 1996, p.1353-1387.

    5，郭元吉，董婕，王敏, 等. 甲3（H3N2）亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究. 中华实验和临床病毒学杂志, 1998, 12(1):18-22.

    6，Vines A, Wells K, Matrosovich M, et al. The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction. J Virol, 1998, 72:7626-7631.

   (收稿日期：1999-03-22)