通心络胶囊对脑缺血―再灌注大鼠保护作用的实验研究

    摘要目的 :探讨通心络胶囊保护神经元缺血性损伤的作用机制。方法 :28只Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为 5组 :空白对照组 (4只 )、伪手术对照组 (4只 )、通心络胶囊小剂量组 (8只 )、通心络胶囊大剂量组 (8只 )、华佗再造丸组 (4只 )。分离培养鼠脑毛细血管内皮细胞 (ＣＣＥＣ)和多形核白细胞(ＰＭＮ),利用微管吸吮技术 ,观察ＰＭＮ与ＣＣＥＣ间黏附力学特性的变化。结果 :脑缺血 -再灌注后各时间点 ,ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附力和黏附应力均明显高于正常对照组和伪手术组 (Ｐ均 <0. 01);加用通心络胶囊后 ,细胞黏附力和黏附应力均明显下降 (Ｐ <0. 05或Ｐ <0. 01)。结论 :通心络胶囊可使脑缺血―再灌注损伤后ＰＭＮ与ＣＣＥＣ间黏附力减弱 ,黏附应力下降。通心络胶囊将可能成为治疗缺血性脑血管疾病的新的有效药物。

    多形核白细胞 (ＰＭＮ)在脑缺血 -再灌注损伤中起重要作用。它可阻塞微血管 ,释放自由基和颗粒酶等。研究表明 ,ＰＭＮ在微血管内聚集与ＰＭＮ和内皮胞黏附性增加密切相关 ,用抗巨噬细胞活化趋化因子 - 1(Ｍａｃ - 1)和抗细胞间黏附分子 - 1(ＩＣＡＭ - 1)抗体可使脑缺血后缺血区损伤减轻。通心络胶囊是根据中医络病理论研制而成的中药复方制剂 ,具有益血活血、通络止痛之功效 ,临床用于治疗缺血性脑血管疾病取得良好疗效。为探讨其作用机制 ,我们使用微管吸吮技术 ,在体与离体实验相结合 ,进行了通心络胶囊对脑缺血 -再灌注大鼠保护作用的实验研究。

    材料与方法

    1.实验动物及分组 :选成年雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 28只 ,体重 250～ 300ｇ。随机分为 5组 :通心络小剂量组 (ｎ =8):给予通心络胶囊 0. 5ｇ/ｋｇ ;通心络大剂量组 (ｎ =8):给予通心络胶囊 1. 0ｇ/ｋｇ ;华佗再造丸组 (ｎ =4);给予华佗再造丸 3ｇ/ｋｇ ;空白对照组 (ｎ =4):给予生理盐水 3ｍｌ/ｋｇ ;伪手术对照组(ｎ = 4)。用戊巴比妥钠 (40ｍｇ/ｋｇ体重 )腹腔注射麻醉。切开颈部 ,分离右侧颈总动脉 (ＣＣＡ)、颈外动脉 (ＥＣＡ)和颈内动脉 (ＩＣＡ),用电热烧灼器凝闭ＥＣＡ的分支。在ＥＣＡ剪一小口 ,将尼龙线插入ＥＣＡ ,经ＣＣＡ分叉处通过ＩＣＡ入颅到大脑中动脉 ,造成大鼠局灶性脑缺血模型。伪手术对照组仅在麻醉后切开颈部皮肤 ,分离颈内动脉。各用药组连续灌胃 10天 ,容量为 10ｍｌ/100ｇ体重。

    2.各组分别在伪手术后和脑缺血―再灌注后 4ｈ、12ｈ和 24ｈ各抽取静脉血 2～ 4ｍｌ,用右旋糖酐沉降及Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度法分离出ＰＭＮ ,离心 (1500ｒ/ｍｉｎ)15ｍｉｎ备用。大鼠毛细血管内皮细胞(ＣＣＥＣ)的制备采用 0. 01%弹性蛋白酶灌注脑 30ｍｉｎ ,取软脑膜及脑表面组织 ,剪碎后 2000目滤网过滤 ,用Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心 (1000～ 1500ｒ/ｍｉｎ)5ｍｉｎ ,分离出ＣＣＥＣ ,从形态上并用凝血因子Ⅶ相关抗原免疫荧光鉴定。ＣＣＥＣ均取自正常大鼠 ,培养 72～ 9 6ｈ ,分别加入各组不同时间点的ＰＭＮ ,静置 1ｈ后进行微管吸吮实验。

    3.微管吸吮系统及方法 :该系统包括倒置显微镜、显微操作器、图像分析仪、微管、压力控制和记录系统等部分。微管内径 0. 06～ 3. 12μｍ。整个系统在图像监视器上放大 3500倍 ,并用 40μｍ的光栅尺进行标定。将实验样本置于倒置显微镜载物台上 ,在显微镜下确认待测试的ＰＭＮ -ＣＣＥＣ黏附细胞对后 ,利用显微操作器引导微管尖端靠近ＰＭＮ表面 ,通过压力控制系统产生一定的负压以吸吮ＰＭＮ ,用显微操作器牵引ＰＭＮ离开与其黏附的ＣＣＥＣ。以 9 . 8Ｐａ(1Ｐａ =0.102ｍｍＨ2Ｏ)为步长 ,逐步增加吸吮负压 ,直到求得使ＰＭＮ与ＣＣＥＣ间黏附分离的临界负压值(△Ｐ)。2940

    4.黏附力的计算 :微管尖端靠近黏管的ＰＭＮ后 ,在对细胞进行吸吮之前利用显微摄像及图像处理系统 ,测得ＰＭＮ的半径 (Ｒｃ)及微管尖端半径 (Ｒｐ)。定义ＰＭＮ与ＣＣＥＣ间黏附力 (Ｆ)和相对黏附应力 (Ｓ)为 :Ｆ =△ＰπＲｐ2,Ｓ =△Ｐ(Ｒｐ/Ｒｃ)2。以Ｆ和Ｓ两个指标作为评价ＰＭＮ和ＣＣＥＣ间黏附强度的定量依据。

    5.统计学处理 :数据用均数±标准差 (ｘ±ｓ)表示 ,配对ｔ检验进行显著性分析。

    结果

    1.正常对照组大鼠ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附力为 (3. 26± 0. 18)Ｎ ,相对黏附应力为 (0. 75± 0. 05)Ｐａ。

    2.各组大鼠伪手术后或脑缺血―再灌注不同时间点ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附力的变化见表 1。空白对照组和脑缺血加通心络组ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附力在脑缺血―再灌注损伤后 4ｈ即明显升高 ,与正常对照组和伪手术组比较均有显著性差异 (Ｐ均 <0. 01),而脑缺血―再灌注各时间点脑缺血加通心络胶囊组ＣＣＥＣ黏附力均明显低于脑缺血组 (Ｐ均 <0. 01)。

    3.各组大鼠脑缺血―再灌注损伤后不同时间点ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附应力的变化见表 2。脑缺血和脑缺血加抗体组ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附应力的变化与黏附力的变化基本一致 :脑缺血―再灌注损伤后 4ｈ明显升高 ,与正常对照组及伪手术组比较均有显著性差异 (Ｐ均 <0. 01或Ｐ <0. 05)。

    讨论对细胞间的黏附现象人们早有认识。特别是 2 0世纪 80年代以来 ,免疫学和分子生物学技术的发展 ,极大地推动了对黏附分子的研究。实验和临床研究已经证明 ,Ｍａｃ - 1、淋巴细胞功能相关抗原 (ＬＦＡ - 1)与配体ＩＣＡＭ - 1调节着ＰＭＮ与血管内皮细胞的黏附 ,参与了炎症反应等许多重要的生理和病理反应。研究表明 ,缺血性脑血管疾病的发生、发展与黏附分子的作用密切相关。

    19 9 1年Ｃｌａｒｋ等报道在兔脑梗塞模型中使用抗ＩＣＡＭ - 1抗体减轻了脑缺血损伤。 19 9 3年以来Ｂｏｗｅｓ等和Ｚｈａｎｇ等报道在鼠大脑中动脉缺血―再灌注损伤中使用抗ＩＣＡＭ - 1抗体 ,减轻了脑缺血性损伤。 19 9 4年Ｃｈｏｐｐ等报道了使用抗Ｍａｃ -单抗在鼠大脑中动脉梗塞后减轻了缺血细胞的损伤。以上实验虽然表明抗Ｍａｃ- 1单抗和ＩＣＡＭ - 1抗体均使脑缺血性损伤减轻 ,但尚无Ｍａｃ-1抗体和抗ＩＣＡＭ - 1抗体抑制ＰＭＮ与内皮细胞黏附的直接依据。

    通心络胶囊由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣等中药配伍研制而成。动物实验表明通心络胶囊可以缩小脑梗塞体积 ,降低脑血管阻力 ,增加脑血流量 ,但具体机制尚不明了。而随着细胞流变学技术的不断发展 ,微管吸吮技术的应用可以较为科学地评价单个白细胞的黏附特性和变形特性。本研究应用微管吸吮技术 ,较为直观地观察了ＰＭＮ与ＣＣＥＣ在脑缺血后不同时间黏附力的变化 ,以及脑缺血后使用通心络胶囊对ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附力的影响。实验结果显示 ,脑缺血 -再灌注损伤大鼠ＰＭＮ与ＣＣＥＣ黏附力较正常情况下明显增强 , 12ｈ为最强 ;而使用通心络胶囊明显抑制了ＰＭＮ与ＣＣＥＣ的黏附。本研究同时计算了ＰＭＮ与ＣＣＥＣ的黏附应力变化 ,结果与黏附力变化趋势一致。黏附应力由于考虑到了ＰＭＮ与微管的半径 ,比黏附力反映黏附特性变化更为合理。本实验结果表明 ,通过抑制ＰＭＮ与ＣＣＥＣ的黏附 ,通心络胶囊将可能成为治疗缺血性脑血管病的一条新的有效途径。