通心络促脑缺血后血管内皮生长因子表达的实验研究

    现任重庆医科大学神经病学研究所所长 ,重庆医科大学一附院神经内科教授、博士生导师。兼任中华医学会神经专业委员会常务委员 ,中华医学会重庆分会神经科专业委员会主任委员 ,《中国神经精神疾病杂志》副主编等职。长期从事脑血管疾病的基础与临床研究 ,在国内外发表论文 100余篇 ,出版专著 2部 ,参编多部。获国家科技进步奖三等奖 1项 ,卫生部科技进步二等奖 1项 ,四川科技进步一等奖 1项、三等奖 4项。 2001年获全国优秀科技工作者称号。

    摘要

    目的 :探讨通心络对大脑中动脉梗塞后血管内皮生长因子表达的影响。

    方法 :以线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型 (ＭＣＡＯ ),大鼠随机分为假手术对照组、ＭＣＡＯ组、通心络干预组。以免疫组织化学法及ＨＥ染色法分别检测脑组织病理学变化、ＶＥＧＦ阳性表达。

    结果 :大脑中动脉梗塞后 ,缺血区神经元变性、坏死、ＶＥＧＦ在半暗带有少量表达 ,经通心络干预后 ,ＶＥＧＦ大量表达。

    结论 :通心络可通过促ＶＥＧＦ表达上调 ,内皮细胞增殖 ,从而保护脑毛细血管内皮细胞 ,促进毛细血管新生。

    目前 ,缺血性脑血管病的治疗以溶栓和神经保护治疗为主 ,无论是溶栓 ,还是神经保护治疗 ,目的均为恢复缺血区脑组织的血液供应 ,保护微血管、神经元 ,促进毛细血管新生 ,侧枝循环重建 ,神经结构重塑 ,使神经功能尽快尽可能恢复 [1]。现已证实ＶＥＧＦ是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂源 ,在病理情况下能促进内皮细胞分裂、增殖 ,使毛细血管新生 [2]。因此 ,如何促进血管内皮细胞生长因子表达上调、促脑毛细血管新生 ,是当前脑缺血研究的热点 [3]。迄今 ,在众多中药制剂中 ,尚无一种药物进行过这一方面的研究 ,通心络 [4]是根据中医理论研制而成的含多种虫类中药的复方制剂 ,具有益气活血的功效 ,在脑血管病治疗中具有良好的效果 ,因此本文选择通心络进行研究 ,观察通心络对脑梗塞后ＶＥＧＦ表达的作用。

    材料与方法

    主要仪器和试剂 - 70℃冰箱 (Ｓｈａｒｐ ,日本 );微量移液器 (Ｇｉｌｓｏｎ ,法国 );ＢＨ - 2型Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜 (日本 );彩色病理图像分析仪 (日本 );ＶＥＧＦ兔多克隆抗体 (Ｓａｎｔａ,美国 );ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒 (武汉博士德公司 )。

    实验动物模型 :雄性健康的Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (250± 20ｇ),采用右侧大脑中动脉线栓法梗塞模型(ＭＣＡＯ)。 3. 5%的水合氯醛腹腔麻醉 (10ｍｌ/ｋｇ),大鼠仰卧位固定 ,经颈部切开暴露左侧颈总动脉(ＣＡ)、颈外动脉 (ＥＣＡ)、颈内动脉颅外段 (ＩＣＡ),在颈外动脉近颈总动脉分叉处剪一切口 ,将栓子(尼龙绳线 ,直径 0. 24ｍｍ ,长 20ｍｍ)向颈内动脉颅内方向插入 (17. 5～ 18)ｍｍ遇阻力而停止 ,栓子头端即达大脑中动脉ＭＣＡ起始部。将ＭＣＡ起始部和ＩＣＡ末端同时堵塞 ,同时用Ｚｉｎ氏夹 ,夹闭颈外动脉切口近端 ,缝合皮肤 ,栓塞即告完成。术后 1小时 ,大鼠清醒 ,置单笼饲养观察 ,根据Ｂｅｒｄｅｒｓｏｎ检查评级方法观察记录 ,大鼠术后爬行 ,不能走直线 ,而呈弯向栓塞血管对侧的环状爬行评为Ⅲ级。

    实验分组 :实验大鼠被随机分成 3组 ,每组 6只。假手术对照组 :手术过程及时间同其他组 ,但不阻断血供。ＭＣＡＯ组 :每日 0. 05ｍｌ/ｋｇ生理盐水连续灌胃 7天后行右侧大脑中动脉梗塞术 ,术后Ⅲ级大鼠入选 ,术后连续生理盐水灌胃 7天。ＴＣＬ干预组 :每日 2. 5ｇ/ｋｇＴＸＬ连续灌胃 7天后行ＭＣＡＯ手术 ,术后连续灌胃 7天。

    组织学观察

    大鼠处死后取脑置 10%福尔马林液固定 ,常规切片 ,ＨＥ染色 ,进行组织学观察。3117

    ＶＥＧＦ蛋白表达的免疫组化染色

    给予术后 7天大鼠麻醉后行左心室灌注固定、取脑 , 4%ＰＦＡ(多聚甲醛 )外固定 , 10%蔗糖浸泡后 ,液氮连冻 1分钟 ,恒冷切片机上在大脑中部作冠状切片 ,切片冷风吹干 ,纯丙酮室温固定 20～3 0分钟。ＳＡＢＣ法检测ＶＥＧＦ蛋白表达。蒸镏水洗 ,纯甲醇加Ｈ2Ｏ2至 0. 5%,室温浸泡 30分钟 ,以灭活内源性过氧化物酶 ,蒸馏水洗 3次 ,滴加正常山羊血清封闭液 ,室温 20分钟。甩去多余液体 ,不洗。滴加适当稀释的―抗 , 4℃过液。 0. 1ＭＰＢＳ冼 2分钟× 3次 ,滴加生物素化山羊抗免ＩｇＧ , 37℃ , 20分钟 , 0. 1ＭＰＢＳ洗 2分钟× 3次 ,滴加试剂ＳＡＢＣ , 20℃～ 37℃ , 20分钟 , 0. 1ＭＰＢＳ洗 5分钟× 4次 ,ＤＡＢ显色 ,镜下控制反应时间 ,蒸馏水洗涤 ,脱水 ,透明 ,封片。显微镜观察。统计学分析 :所有资料以Ｘ±ＳＤ表示 ,两组间比较用ｔ检验 ,Ｐ <0. 05为有统计学差异 ,Ｐ <0. 01认为具有显著性差异。

    结果

    脑组织病理学改变

    假手术对照组大鼠皮层组织细胞排列有序 ,细胞结构完整 ,细胞内可见ＮｉＳＳ小体 ,核清楚 ,组织间隙无异常。ＭＣＡＯ组 :神经细胞呈缺血性改变 ,核消失 ,胞体增大 ,染色变淡 ,边缘不规则 ,核固缩 ,细胞周围水肿明显 ,组织结构疏松 ,水肿明显 ,呈海棉状。ＴＸＬ干预组 :缺血神经元数目减少 ,组织结构水肿减轻。

    ＶＥＧＦ免疫组化及图像分析

    假手术对照组无ＶＥＧＦ阳性神经元表达 ,ＭＣＡＯ组在缺血中心及周边区神经元、缺血侧软脑膜细胞、海马神经元均有ＶＥＧＦ弱表达 ;与ＭＣＡＯ组比较 ,ＴＸＬ干预组上述部位有ＶＥＧＦ强阳性表达。

    讨论

    脑缺血后ＶＥＧＦ的表达与新血管生成

    血管新生 ,即原有的血管又产生新的血管 5??。成年人器官 ,生理性的血管新生是很少见的。在月经期和妊娠期 ,女性生殖器官可以有血管新生。血管新生还可以发生在病理的情况下 ,例如缺血、炎症、伤口愈合等。血管新生是一个复杂的过程 ,包括一系列衔接非常准确的过程。脑血管闭塞以后 , 24小时内内皮细胞开始大量增殖 , 72小时缺血区有新生的毛细血管 6??。毛细血管新生的范围与程度直接关系到缺血边缘区血流的改善 ,影响神经元生理功能的恢复 ,从而决定了患者的预后 1??。新血管的形成来源于先前存在的血管的内皮细胞增殖 ,而内皮细胞增殖 ,有赖于ＶＥＧＦ的刺激 7??。ＶＥＧＦ是一种内皮细胞的特异性有丝分裂源 ,在体外可促进内皮细胞的生长 ,在体内可诱导血管生成 1??。这种作用主要是由于ＶＥＧＦ对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用 ,ＶＥＧＦ对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶短暂地诱导Ｃａ + +释放而发生的 8??。ＶＥＧＦ为分泌性蛋白 ,作用于特异性受体 ,从而保护脑毛细血管内皮细胞 ,防止毛细血管消失 ,同时刺激内皮细胞增殖 ,血管新生 ,神经功能迅速恢复 9、10、11??。

    通心络对缺血后ＶＥＧＦ表达及新血管生成的作用

    既往的研究发现 ,脑缺血后血流增加可诱导ＶＥＧＦ的大量表达 12?? ,既往的通心络试验表明 ,它具有降低脑缺血后血液黏度 ,降低脑血管阻力 ,增加脑缺血后脑血流量的作用 4??。因此从理论上讲 ,具有诱导ＶＥＧＦ表达的可行性 ,本实验进一步证实了上述观点。在对ＭＣＡＯ大鼠进行通心络预防性和治疗性给药后 ,大鼠脑组织缺血半暗带神经元、海马神经元及软脑膜、室管膜等有大量的ＶＥＧＦ表达 ,结果表明 :通心络能够通过促进ＶＥＧＦ大量表达而保护脑毛细血管内皮细胞 ,防止毛细血管消失 ,促毛细血管新生 ,从而具有脑保护功能。